納米生物探針的制備及DNA損傷檢測(cè)應(yīng)用.pdf

1、DNA是機(jī)體生命活動(dòng)最重要的遺傳物質(zhì)，DNA損傷則是生物體內(nèi)經(jīng)常發(fā)生的事件，損傷的類型主要包括DNA氧化和堿基修飾。DNA甲基化歸屬于DNA堿基修飾這一大類，它對(duì)DNA造成的損傷雖然不改變DNA序列，但能導(dǎo)致DNA中共價(jià)鍵的改變，使可遺傳的基因表達(dá)發(fā)生改變，從而影響基因的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯，影響儲(chǔ)存遺傳信息的載體。DNA甲基化是發(fā)現(xiàn)最早的、最基本的，也是研究最多的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。正常細(xì)胞功能的行使有賴于表觀遺傳的穩(wěn)態(tài)的維持，而大量研究證明D

2、NA不正常的甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)，影響基因的活性和功能，而這些表觀遺傳的穩(wěn)態(tài)的打亂是與多種復(fù)雜疾病以及各類癌癥的發(fā)病密切相關(guān)的。特別是癌癥，其發(fā)生過程中癌細(xì)胞基因組局部區(qū)域的超甲基化和整體的欠甲基化是其典型的特征。超甲基化體現(xiàn)在抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)被異常甲基化;而重復(fù)序列以及癌基因的啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度減小、基因組遺傳不穩(wěn)定性的增加會(huì)直接導(dǎo)致整體的欠甲基化。因

3、此，建立快速、靈敏、低成本的檢測(cè)方法來檢測(cè)DNA甲基化和甲基轉(zhuǎn)移酶活性，對(duì)各類疾病尤其癌癥進(jìn)行早期診斷和治療，對(duì)于提高疾病患者的生存率，具有十分重要的意義。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴富含胞嘧啶(G)堿基的DNA與捕獲DNA和靶向DNA在金電極上形成特異性探針，通過G4聯(lián)體和血紅素構(gòu)建的HRP模擬酶來催化誘導(dǎo)苯胺聚合生成聚苯胺，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)。但加入核酸酶后，探針中含有特異序列的雙鏈DNA就會(huì)被識(shí)別、切割，并進(jìn)一步被消化

4、，富含G堿基的DNA從電極上脫落。則無(wú)法通過G4聯(lián)體來構(gòu)建HRP模擬酶，沒有酶的催化作用，后續(xù)苯胺的聚合不能進(jìn)行，從而導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)消失。當(dāng)雙鏈DNA中的CG位點(diǎn)被甲基化后，會(huì)有效抑制核酸酶的識(shí)別、切割和消化，則HRP模擬酶催化生成聚苯胺，從而保留了電化學(xué)信號(hào)。采集到的電化學(xué)信號(hào)與DNA甲基化程度和甲基轉(zhuǎn)移酶活性直接相關(guān)，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建的生物傳感器對(duì)M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測(cè)限為0.12 UmL-1，能對(duì)DNA甲基化進(jìn)行特異性檢測(cè)

5、，還可用于DNA甲基化抑制劑的相關(guān)檢測(cè)。⑵通過與含有5'-CCGG-3'特定序列的DNA雜交，將探針DNA修飾的金納米粒子組裝在金電極表面，探針DNA可以引發(fā)兩個(gè)發(fā)夾DNA交替進(jìn)行模擬-雜交鏈反應(yīng)，從而在電極上形成眾多的超長(zhǎng)雙鏈DNA，促使電化學(xué)指示劑六銨合釕的大量嵌插，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的電化學(xué)信號(hào)。但未經(jīng)甲基化的5'-CCGG-3'序列會(huì)被特定的核酸酶識(shí)別和剪切，從電極上脫落，模擬-雜交鏈反應(yīng)就不會(huì)被引發(fā)，故沒有電化學(xué)響應(yīng);反之，DNA的

6、甲基化會(huì)保護(hù)該序列不被核酸酶切割，則依然可以采集到強(qiáng)烈的電化學(xué)信號(hào)。由于金納米粒子和模擬-雜交鏈反應(yīng)的協(xié)同作用，使得雜交鏈反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，從而電化學(xué)信號(hào)大大增強(qiáng)，所以本法對(duì)M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)限降至0.03 U mL-1，顯著提升了傳感器的靈敏度，并且方法的特異性和重復(fù)性都很好，能用于甲基化抑制劑的檢測(cè)。⑶利用石墨烯材料表面豐富的親水基團(tuán)和獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)，合成了還原型石墨烯和殼聚糖的納米復(fù)合物，并用其在電極上共價(jià)結(jié)合乙酰膽堿酯酶構(gòu)