變構(gòu)適體探針的設(shè)計(jì)、篩選及其在生物分析檢測中的應(yīng)用.pdf

1、核酸變構(gòu)探針，是指通過構(gòu)象變化引發(fā)功能單元活性變化從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)檢測的DNA或RNA分子;核酸適體，是指一類通過人工篩選獲得的能夠和目標(biāo)分子高特異性、高親和性結(jié)合的單鏈寡核苷酸。由兩者結(jié)合形成的變構(gòu)適體探針是包含核酸適體的變構(gòu)探針，相較于普通核酸探針具有更廣泛的目標(biāo)物和更靈活的信號輸出方式，可用于小分子、核酸、蛋白質(zhì)等生物檢測分析。我們發(fā)展了一種包含鏈霉親和素核酸適體的單熒光標(biāo)記變構(gòu)探針，實(shí)現(xiàn)DNA甲基化酶的靈敏檢測分析。另外，我們將基于

2、競爭結(jié)合原理的變構(gòu)核酸適體篩選方法應(yīng)用于TNF-α蛋白變構(gòu)核酸適體的篩選。本論文的研究內(nèi)容主要包括以下兩個(gè)方面:
　　1、包含鏈霉親和素核酸適體的變構(gòu)探針設(shè)計(jì)和應(yīng)用于DNA甲基化酶檢測及酶抑制劑分析。設(shè)計(jì)合成一種單熒光標(biāo)記的包含鏈霉親和素核酸適體的發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針，穩(wěn)定的頸環(huán)結(jié)構(gòu)將適體分子的親和力封閉，只有甲基化酶將探針頸部特定位點(diǎn)甲基化后，該位點(diǎn)才能夠發(fā)生特異性切割反應(yīng)從而釋放適體分子，攜帶熒光分子的鏈霉親和素核酸適體與鏈霉親和素瓊

3、脂糖微珠高效結(jié)合，形成熒光微球。通過流式細(xì)胞分析技術(shù)或激光共聚焦顯微鏡對熒光信號定量分析，實(shí)現(xiàn)靶分子DNA甲基化酶的定量檢測。本方法可以實(shí)現(xiàn)0.57 U/mL的檢測限，并具有很好的選擇性。此外，該方法能夠用于酶抑制劑研究，結(jié)果表明5-氟尿嘧啶對DNA甲基化酶的半抑制劑濃度為0.91μM。
　　2.篩選TNF-α蛋白的變構(gòu)核酸適體。通過生物素化的捕獲DNA與含30個(gè)隨機(jī)序列的DNA文庫互補(bǔ)，從而將文庫固定在鏈霉親和素瓊脂糖微珠表面，