量子點(diǎn)—生物分子復(fù)合探針的構(gòu)建及其在生物分析中的應(yīng)用.pdf

1、量子點(diǎn)是一種新型的半導(dǎo)體納米顆粒,是納米生物光子學(xué)重要的工具之一。量子點(diǎn)作為一種極具應(yīng)用前景的信號(hào)探針,與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比,具有寬而有效的激發(fā)譜,窄而對(duì)稱(chēng)的發(fā)射譜,高的熒光量子效率,優(yōu)異的光化學(xué)穩(wěn)定性,方便靈活的表面可修飾性,以及發(fā)射波長(zhǎng)尺寸可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)?；谶@些獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì),結(jié)合先進(jìn)的分析檢測(cè)技術(shù)和平臺(tái),量子點(diǎn)在生物分析中的應(yīng)用日益廣泛,包括細(xì)胞與組織標(biāo)記、生物分子跟蹤與檢測(cè)、免疫反應(yīng)分析等方面,并取得了許多重要成果。但是,縱觀量

2、子點(diǎn)在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用,大部分的機(jī)理都是基于生物分子之間的特異性相互作用。因此,構(gòu)建量子點(diǎn).生物分子復(fù)合探針,使量子點(diǎn)具有特異性靶向作用的同時(shí),保持其熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性,并且盡量減少其他生物分子的非特異性吸附,這對(duì)于量子點(diǎn)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用,起著尤為關(guān)鍵的作用。
　　隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,醫(yī)學(xué)檢測(cè)中要求化驗(yàn)和檢驗(yàn)的儀器具有更高靈敏度、更短檢測(cè)時(shí)間、更小體積、便攜化。而新近發(fā)展起來(lái)的生物芯片技術(shù),即微流控芯片技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)能夠很好

3、地滿(mǎn)足這些要求。目前,微流控芯片主要應(yīng)用于基因測(cè)序、蛋白質(zhì)圖譜分析等高、精、尖領(lǐng)域。隨著微流控芯片技術(shù)的不斷成熟和制作成本的不斷降低,必將大規(guī)模地進(jìn)入到常規(guī)醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域,取代那些笨重而且操作復(fù)雜的化驗(yàn)、檢驗(yàn)設(shè)備,進(jìn)而促進(jìn)醫(yī)療水平的進(jìn)步。然而,目前微流控芯片的檢測(cè)靈敏度和特異性仍然有待提高。
　　我們課題組在水相合成高性能量子點(diǎn)方面有很好的基礎(chǔ),利用微波輔助水相量子點(diǎn)制備技術(shù),制備了優(yōu)良性能的水分散性量子點(diǎn)。基于這個(gè)優(yōu)勢(shì),我們?cè)噲D開(kāi)

4、展一些原創(chuàng)性、有實(shí)際意義的研究工作,將量子點(diǎn)信號(hào)探針和微流控芯片檢測(cè)平臺(tái)相結(jié)合,充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì),克服彼此的缺陷:即量子點(diǎn)優(yōu)異的熒光性能,有助于提高微流控芯片的檢測(cè)靈敏度,并擴(kuò)大其應(yīng)用范圍;微流控芯片技術(shù)的可控性、高通量,有利于提升量子點(diǎn)探針的標(biāo)識(shí)能力。本文構(gòu)建了一系列性能優(yōu)良的量子點(diǎn).生物分子復(fù)合探針,并將這些復(fù)合探針用于微流控芯片,對(duì)生物分子進(jìn)行檢測(cè)。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.構(gòu)建了一種新型的微流控芯片檢測(cè)體系。
　

5、　這種微流控芯片是由PDMS片層和芯片基片組成。借助此微流控技術(shù)平臺(tái),實(shí)現(xiàn)了生物分子在固相表面的固定組裝、識(shí)別、捕獲、檢測(cè)等一系列的生物反應(yīng)過(guò)程。此芯片制作成本低,易于操作,可實(shí)現(xiàn)不同種類(lèi)、不同濃度的生物分子在微流控芯片上的快速分析。與傳統(tǒng)的微陣列芯片相比,這種微流控芯片技術(shù)能夠更好地保持生物分子的活性,樣品消耗量很少,不需要昂貴的點(diǎn)樣儀,對(duì)環(huán)境也沒(méi)有嚴(yán)苛的要求,并且流體具有可控性,有利于提高生物分子之間的結(jié)合效率,提高檢測(cè)靈敏度和特異

6、性。
　　2.構(gòu)建了量子點(diǎn)一親和素復(fù)合探針,并將這種探針用于微流控蛋白質(zhì)芯片。
　　基于靜電相互作用,將帶相反電荷的量子點(diǎn)和親和素自組裝,形成了量子點(diǎn)-親和素復(fù)合探針,并將這種納米生物復(fù)合探針作為信號(hào)探針,用于微流控蛋白質(zhì)芯片,對(duì)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件的不斷改進(jìn)和優(yōu)化,克服了PDMS微通道和基片對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性吸附,減小了量子點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性吸附,降低了芯片的背景信號(hào),提高了量子點(diǎn)在芯片上的信號(hào)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7、表明,相對(duì)于傳統(tǒng)的熒光染料(FITC),采用量子點(diǎn)作為信號(hào)探針,無(wú)論是信號(hào)強(qiáng)度,信號(hào)穩(wěn)定性,還是檢測(cè)靈敏度,都有明顯的提高。這是首次將量子點(diǎn)引入到微流控蛋白質(zhì)芯片中。量子點(diǎn)在微流控芯片上的優(yōu)異表現(xiàn),證實(shí)了我們所構(gòu)建的檢測(cè)體系,充分地融合了量子點(diǎn)和微流控技術(shù)的優(yōu)勢(shì),為蛋白質(zhì)的檢測(cè)和分析提供了一個(gè)新穎而有效的途徑。
　　3.構(gòu)建了量子點(diǎn).免疫球蛋白復(fù)合探針,并將這種探針用于微流控蛋白質(zhì)芯片。
　　基于共價(jià)偶聯(lián)的機(jī)理,將量子點(diǎn)和免

8、疫球蛋白(羊抗鼠二抗)連接,形成了量子點(diǎn)-免疫球蛋白復(fù)合探針。詳細(xì)地探討了共價(jià)連接對(duì)量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性的影響,制備得到了有效且穩(wěn)定的量子點(diǎn)生物探針。本文將這種量子點(diǎn)生物探針,用于微流控蛋白質(zhì)芯片,采用夾心免疫分析法,實(shí)現(xiàn)了緩沖液和血清中腫瘤標(biāo)志物的高特異性、高靈敏度檢測(cè);采用反相免疫分析法,實(shí)現(xiàn)了混合樣品的多元檢測(cè)和多色成像。對(duì)于真實(shí)樣本和復(fù)雜樣本的有效檢測(cè),預(yù)示著這種檢測(cè)體系在臨床檢測(cè)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域具有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力,為理論

9、研究向?qū)嶋H應(yīng)用轉(zhuǎn)換提供了有利的技術(shù)支撐。
　　4.構(gòu)建了量子點(diǎn)-DNA-生物素-鏈霉親和素復(fù)合探針,并將這種探針用于微流控蛋白質(zhì)芯片。
　　本文提出了一種新型的以DNA作為“橋梁”的蛋白質(zhì)在量子點(diǎn)表面可控組裝的策略。作為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),我們?cè)O(shè)計(jì)并制備了量子點(diǎn)-DNA-生物素-鏈霉親和素(QD-DNA-biotin-STV)納米生物復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)表明,組裝得到的復(fù)合物具有很高的熒光強(qiáng)度、穩(wěn)定性,以及生物分子的活性。將這種量子點(diǎn)復(fù)合探針

10、作為信號(hào)探針,用于微流控蛋白質(zhì)芯片,實(shí)現(xiàn)了腫瘤標(biāo)志物的高特異性、高靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)限達(dá)到50fM,比有機(jī)熒光染料的檢測(cè)限低4個(gè)數(shù)量級(jí);比量子點(diǎn).親和素復(fù)合探針的檢測(cè)限低一個(gè)數(shù)量級(jí)。這種組裝策略避免了對(duì)量子點(diǎn)和生物分子的破壞,非常溫和、可控、有效,具有很高的普適性,將在生化分析和臨床應(yīng)用中有廣泛的應(yīng)用前景。
　　5.構(gòu)建了量子點(diǎn)-DNA復(fù)合探針,并將這種探針用于微流控DNA芯片。
　　基于配體交換的原理,巰基修飾的DNA部分取

11、代量子點(diǎn)表面的巰基配體,制備得到量子點(diǎn)-DNA復(fù)合探針。通過(guò)控制組裝條件,得到了不同組裝密度的量子點(diǎn)-DNA復(fù)合探針。構(gòu)建了基于雙色量子點(diǎn)的FRET體系,實(shí)現(xiàn)了靶DNA均相檢測(cè)。首次將量子點(diǎn)-DNA探針應(yīng)用于微流控DNA芯片,實(shí)現(xiàn)了靶DNA的非均相檢測(cè)。實(shí)現(xiàn)結(jié)果表明,檢測(cè)具有比較高的靈敏度,檢測(cè)限達(dá)到了50fM。除此之外,這種檢測(cè)體系能夠有效地區(qū)分完全互補(bǔ)序列、單堿基錯(cuò)配、非互補(bǔ)序列,具有很強(qiáng)的特異性和選擇性,為DNA的檢測(cè)提供了一種全

12、新而有效的檢測(cè)途徑。
　　6.發(fā)展了一種基于量子點(diǎn)的葡萄糖非標(biāo)記檢測(cè)法。
　　首先證實(shí)了過(guò)氧化氫對(duì)量子點(diǎn)的熒光淬滅效應(yīng)。基于葡萄糖氧化酶對(duì)葡萄糖的氧化催化反應(yīng),伴隨有過(guò)氧化氫生成,因此通過(guò)監(jiān)測(cè)量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的變化,檢測(cè)葡萄糖的濃度。實(shí)驗(yàn)表明,這種檢測(cè)方法對(duì)濃度為微摩爾/升到毫摩爾/升的葡萄糖都能有效地檢測(cè),檢測(cè)限為1.8μM。另外,基于同樣的檢測(cè)原理,采用96孔板作為檢測(cè)平臺(tái),實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)樣品和血液樣本中葡萄糖的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果