基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)尋找t(821)急性髓系白血病預(yù)后相關(guān)基因及其異質(zhì)性研究.pdf

1、目的:我國現(xiàn)已成為惡性腫瘤發(fā)病大國，其中成人白血病患者的死亡率高居首位。目前我國白血病發(fā)病率和死亡率具有逐年升高趨勢，每年新發(fā)白血病例約為5萬人，其高昂的診療費(fèi)用給社會和患者家庭帶來極為沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在急性白血病中，急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)屬于一類高度異質(zhì)性的高侵襲性血液病，其發(fā)病主要由于髓系細(xì)胞分化成熟障礙和惡性克隆性增殖所引起。在AML中，最常見的染色體易位之一為t(8;21)(q22

2、;q22)，形成AML1-ETO融合基因。臨床診療中發(fā)現(xiàn)，約有60％的t(8;21)AML患者預(yù)后良好，另40％患者預(yù)后很差，在臨床和基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)的高度異質(zhì)性影響了t(8;21)AML的準(zhǔn)確預(yù)后分層評估，這是干擾這類白血病診療的最關(guān)鍵問題之一。因此，發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)志物，并進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)后分層對于這類患者的改善預(yù)后和提高療效具有十分重要的意義。目前該疾病的預(yù)后相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)志物的研究尚不清楚，而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在研究腫瘤

3、異質(zhì)性方面具有很大優(yōu)勢。因此，本研究在AML1-ETO陽性的t(8;21)AML患者中，應(yīng)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)進(jìn)行測序、生物信息學(xué)分析以及預(yù)后相關(guān)基因篩選，旨在研究單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對t(8;21)AML異質(zhì)性研究的價(jià)值，并尋找新的分子生物學(xué)標(biāo)志物作為可靠的預(yù)后相關(guān)基因，最終為AML的精準(zhǔn)診療提供潛在新靶點(diǎn)。
　　方法:本項(xiàng)目選取了3位AML1-ETO陽性的t(8;21)AML初治和復(fù)發(fā)患者，應(yīng)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對患者外

4、周血或骨髓樣本中共計(jì)193例單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR法鑒別AML1-ETO陽性和陰性的單細(xì)胞樣本。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后，應(yīng)用非監(jiān)督聚類分析法和主成分分析法得到不同預(yù)后的亞克隆;應(yīng)用加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析法(Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA)尋找不同功能的基因模塊;應(yīng)用層次聚類法研究各模塊的相關(guān)性，探索細(xì)胞類群與共表達(dá)模塊之間的功能關(guān)系。然后通過對單細(xì)

5、胞樣本的基因表達(dá)水平分析，從差異基因的表達(dá)分析、差異基因表達(dá)水平的層次聚類、基因熱圖的分析、差異基因的KEGG富集分析及GO分析等方面進(jìn)行深入研究，獲得部分預(yù)后相關(guān)的差異基因。再結(jié)合患者臨床信息，篩選預(yù)后不良基因和預(yù)后良好基因，并在TCGA數(shù)據(jù)庫中選取329例AML患者和50例CBFβ-MYH11陽性AML患者，將預(yù)后相關(guān)基因在大樣本中進(jìn)行生存分析。最終，通過在AML1-ETO陽性、陰性細(xì)胞系和正常人骨髓樣本中的驗(yàn)證，確定t(8，21)

6、AML中與預(yù)后顯著相關(guān)的基因，為其精準(zhǔn)預(yù)后分層和潛在的基因治療新靶點(diǎn)提供理論和實(shí)踐依據(jù)。
　　結(jié)果:實(shí)時熒光定量PCR法共鑒別出89例AML1-ETO陽性和16例AML1-ETO陰性單細(xì)胞樣本。原始的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理、質(zhì)量控制和與參考基因組比對后，獲得Mapped Reads在1million以上符合分析標(biāo)準(zhǔn)的為58例AML1-ETO陽性單細(xì)胞樣本和12例AML1-ETO陰性單細(xì)胞樣本。應(yīng)用非監(jiān)督聚類分析法和主成分分

7、析法，在10220個基因的基礎(chǔ)上將58例AML1-ETO陽性的單細(xì)胞樣本分為預(yù)后低危、中危和高危共三大預(yù)后分層，低危亞克隆A和C、中危亞克隆B和E和高危亞克隆D共5類亞克隆，證明t(8;21)AML具有高度異質(zhì)性。應(yīng)用WGCNA法，在AML1-ETO陽性的單細(xì)胞樣本中發(fā)現(xiàn)許多功能不同的基因模塊;通過對各模塊相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)基因功能性相關(guān)的5個細(xì)胞類群，各細(xì)胞類群內(nèi)部均有較高同質(zhì)性，均可獨(dú)自構(gòu)成基因功能相關(guān)性較高的亞群。在細(xì)胞類群與共表達(dá)

8、模塊的功能關(guān)系分析中，不同的基因模塊在不同的細(xì)胞類群中表達(dá)水平有明顯差異，證實(shí)了主成分分析法和WGCNA法結(jié)果的可靠性。在單細(xì)胞樣本的基因表達(dá)水平分析中，分別從差異基因的表達(dá)分析、差異基因表達(dá)水平的層次聚類、基因的熱圖分析、差異基因的KEGG富集分析及GO分析等進(jìn)行研究后，獲得了預(yù)后相關(guān)的差異基因，并證明雖同樣罹患t(8;21)AML，但不同患者間、不同預(yù)后分層間、不同危險(xiǎn)度亞克隆的AML1-ETO陽性樣本間均存在高度異質(zhì)性，同時證明A

9、ML1-ETO陽性和陰性樣本間也存在高度異質(zhì)性。結(jié)合患者臨床信息，共篩選出563個預(yù)后不良基因和491個預(yù)后良好基因，并在TCGA數(shù)據(jù)庫中的329例AML患者和50例CBFβ-MYH11陽性AML患者進(jìn)行生存分析，結(jié)果獲得預(yù)后不良基因LPCAT2、SNAP47和預(yù)后良好基因TAS2R14。最終通過3種基因在AML1-ETO陽性細(xì)胞系（Kasumi-1和SKNO-1）、AML1-ETO陰性細(xì)胞系(HL-60和SKNO-1-siA/E)和正

10、常人骨髓樣本中的驗(yàn)證，確定了t(8，21)AML的預(yù)后良好基因TAS2R14。本研究為t(8，21)AML的精準(zhǔn)預(yù)后分層和潛在基因治療新靶點(diǎn)提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。
　　結(jié)論:單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤異質(zhì)性的研究方面具有極大優(yōu)勢。本研究通過深入探索單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在t(8;21)AML中的應(yīng)用，證實(shí)可通過該技術(shù)研究該疾病的異質(zhì)性，為AML發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)研究提供了重要依據(jù)。同時，該技術(shù)可精確提供t(8;21)A