急性髓系白血病T淋巴細(xì)胞亞型、相關(guān)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子分析及其與臨床關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、目的：
　　檢測急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者T淋巴細(xì)胞亞型CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4/CD8、NK細(xì)胞等比例，評估AML患者在不同病程階段的細(xì)胞免疫功能差異；檢測 AML患者、正常對照及系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者血漿白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12、干擾素（interferon，IFN）-γ和IL-

2、10表達(dá)水平，以及外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中轉(zhuǎn)錄因子T-box expressed in T cells（T-bet）、GATA binding protein3（GATA3）和Forkhead/winged helix transcription factor（FoxP3）基因mRNA表達(dá)水平；結(jié)合臨床資料，分析IL-12、IFN-γ、IL-10及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（T

3、-bet、GATA3和 FoxP3）表達(dá)水平與 AML的臨床特征及預(yù)后的關(guān)系；并探討重組人白細(xì)胞介素2（recombinant human interleukin-2，rhIl-2）和重組人腫瘤壞死因子（recombinant human tumor-α，rhTNF-α）刺激對AML患者IL-12、IFN-γ、IL-10及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（T-bet、GATA3和FoxP3）表達(dá)水平的影響。從而為進(jìn)一步揭示AML的發(fā)病機(jī)制，探索新的治療策略

4、提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　研究一：AML患者T淋巴細(xì)胞亞型的檢測和臨床意義分析
　　收集58例AML患者，65例對照組外周血，采用雙色或三色直接免疫熒光素法標(biāo)記細(xì)胞抗原，包括細(xì)胞膜表面和胞核抗原，如：CD4、CD25、CD127、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）及效應(yīng)性T細(xì)胞（effector T cell，Teff）等，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞亞型；
　　研究二：IL-

5、12、IFN-γ、IL-10及轉(zhuǎn)錄因子（T-bet、GATA3及 FoxP3）在 AML患者中的表達(dá)及臨床關(guān)聯(lián)研究
　　收集30例AML患者、63例正常對照和27例SLE患者外周血樣本，提取血漿及PBMC，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定血漿IL-12、IFN-γ和IL-10的表達(dá)水平；通過實時定量PCR法（quantitative real-time po

6、lymerase chain reaction，qRT-PCR）測定PBMC中轉(zhuǎn)錄因子（T-bet、GATA3和FoxP3）表達(dá)水平；
　　研究三：IL-2和TNF-α對AML患者PBMC刺激的效應(yīng)研究
　　收集30例AML患者外周血樣本，提取PBMC。使用rhIL-2和rhTNF-α刺激PBMC后，采用ELISA測定上清液中IL-12、IFN-γ和IL-10水平，通過qRT-PCR測定PBMC中T-bet、GATA3和Fo

7、xP3的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　研究一：AML患者T淋巴細(xì)胞亞型的檢測和臨床意義分析
　　（1）全部AML初診患者與正常對照、緩解組及復(fù)發(fā)組T淋巴細(xì)胞亞型檢測結(jié)果比較：四組間CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞、CD4/CD8及Treg/Teff細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均有P<0.05）；進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：初診AML組CD3+T細(xì)胞比例低于正常對照、緩解組及復(fù)發(fā)組（均有 P<0.05）；初診組

8、CD4+T細(xì)胞比例分別低于對照組及緩解組；緩解組CD4/CD8比值高于正常對照組及復(fù)發(fā)組（均有 P<0.05）；復(fù)發(fā)組 Treg細(xì)胞比例高于初診、緩解及正常對照組（均有P<0.05）；繼發(fā)AML組NK細(xì)胞比例分別低于原發(fā) AML組及正常對照組（均有P<0.05）；緩解AML組Treg/Teff比值大于正常對照組、AML復(fù)發(fā)及初診組，復(fù)發(fā)AML組比值高于正常對照組（均有P<0.05）。
　　（2）AML初診患者中，原發(fā)AML與繼發(fā)A

9、ML患者T淋巴細(xì)胞亞型檢測結(jié)果比較：原發(fā)AML患者CD4+T比例、Treg/Teff比例均高于繼發(fā)AML患者（均有P<0.05），CD8+T細(xì)胞比例均低于繼發(fā) AML患者和正常對照（均有 P<0.05），而CD4/CD8比值則高于正常對照組和繼發(fā)AML組（均有P<0.05）。繼發(fā)AML患者CD4+T細(xì)胞比例、CD4/CD8比值均低于正常對照（均有P<0.05），而CD8+T細(xì)胞比例高于正常（P<0.05）。
　　研究二：相關(guān)細(xì)胞因

10、子（IL-12、IFN-γ、IL-10）和轉(zhuǎn)錄因子（T-bet、GATA3、FoxP3）在AML患者中的表達(dá)及臨床關(guān)聯(lián)研究
　?。?）AML、SLE和正常對照血漿IL-12、IFN-γ及IL-10表達(dá)水平的比較：AML組IL-12、IFN-γ及IL-10表達(dá)水平均最低，SLE組IL-12、IFN-γ及IL-10表達(dá)水平均最高，三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均有P<0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，AML組IL-12表達(dá)水平均低于正常對照組和SL

11、E組（均有P<0.05）；AML組IFN-γ表達(dá)水平低于SLE組（P=0.002），SLE組IFN-γ表達(dá)水平高于正常對照組（P=0.003）；AML組IL-10表達(dá)水平低于正常對照組和SLE組（P=0.002；P<0.001）；SLE組IL-10表達(dá)水平高于正常對照組（P=0.040）。
　?。?）IL-10、IL-12與IFN-γ作為AML患者診斷指標(biāo)的ROC曲線分析：IL-12與IFN-γ的ROC曲線面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P

12、=0.781），IL-12與IL-10的ROC曲線面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.637），IL-10與IFN-γ的ROC曲線面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.885）。
　　（3）AML患者、SLE患者與正常對照PBMC中T-bet、FoxP3和GATA3基因mRNA表達(dá)水平比較：AML組T-bet、FoxP3和GATA3基因mRNA的表達(dá)水平均最低，SLE組最高，三組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均有P<0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，AML患者

13、組T-bet基因mRNA的表達(dá)水平低于對照組和SLE組（均有P<0.05）；SLE組T-bet基因mRNA的表達(dá)水平高于對照組（P<0.001）；AML組FoxP3基因mRNA的表達(dá)水平低于SLE組（P<0.001），SLE組FoxP3基因mRNA的表達(dá)水平高于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）；AML組GATA3基因mRNA的表達(dá)水平均低于對照組和SLE組（均有P<0.05）。
　　組（均有P<0.05），SLE組

14、T-bet/GATA3的水平高于正常對照組（P<0.001）。
　?。?）AML患者血漿IL-10、IL-12和PBMC中IFN-γ，T-bet、FoxP3和GATA3基因mRNA表達(dá)與主要臨床特征的關(guān)系：除初診白細(xì)胞>100×109/L患者的GATA3基因mRNA水平低于初診白細(xì)胞<100×109患者外（P=0.040），其余各組的IL-10、IL-12、IFN-γ、T-bet、FoxP3和GATA3間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均有P

15、>0.05）。
　　乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）與細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子之間的相關(guān)性分析：LDH與IL-10、IL-12呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs分別為0.642（P=0.002）和0.662（P=0.001），與GATA3呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.580, P=0.007）。
　?。?）AML、SLE患者IL-10、IL-12、IFN-γ、T-bet、FoxP3、GATA3的相關(guān)性分析：AML患者中

16、 IFN-γ與 IL-10、IL-12呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù) rs分別為0.766（P<0.001）和0.608（P<0.001）；IL-10與 IL-12呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù) rs為0.719（P<0.001）；T-bet與FoxP3之間呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs為0.383（P=0.037）。SLE患者：IFN-γ與IL-10、IL-12、T-bet和FoxP3均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs分別為0.473（P=0.013）、0.608（P=0.0

17、01）、0.408（P=0.035）和0.432（P=0.024）；IL-10與IL-12、T-bet和FoxP3均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs為0.444（P=0.020）、0.399（P=0.039）和0.488（P=0.010）；T-bet與 FoxP3、GATA3之間均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù) rs分別為0.383（P=0.037）、0.722（P<0.001）和0.529（P<0.001）。
　　研究三：IL-2、TNF-α對AML

18、患者PBMC刺激的效應(yīng)研究
　?。?）rhIL-2、rhTNF-α體外刺激對AML患者PBMC上清液中IL-12、IFN-γ和IL-10水平的影響：應(yīng)用3種濃度的rhIL-2刺激后，IL-12、IFN-γ、IL-10表達(dá)均無顯著改變（均有P>0.05）；3種濃度的rhTNF-α刺激，IL-12、IFN-γ、IL-10表達(dá)均無顯著改變（均有P>0.05）。
　?。?）rhIL-2、rhTNF-?體外刺激對 AML患者 PBMC

19、中 T-bet、FoxP3和GATA3mRNA水平的影響：rhIL-2刺激后，GATA3的mRNA表達(dá)無顯著改變（P=0.326）；T-bet的mRNA表達(dá)有顯著變化（P<0.001）；FoxP3的mRNA表達(dá)有顯著變化（P=0.003）。
　　rhTNF-α刺激后，GATA3和 FoxP3的 mRNA表達(dá)均未發(fā)生顯著改變（均有P>0.05）；但T-bet的mRNA表達(dá)有顯著變化（P<0.001）。
　　結(jié)論：
　　初

20、診AML組免疫平衡向抑制性傾斜，繼發(fā)AML組機(jī)體的免疫功能進(jìn)一步受到抑制，進(jìn)而出現(xiàn)CD4/CD8明顯倒置，提示繼發(fā)AML患者免疫功能受損更為嚴(yán)重。復(fù)發(fā)AML組Treg細(xì)胞比例高于初診AML組、AML緩解組和正常對照組。AML患者血漿IL-12和IL-10及PBMC相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（T-bet、GATA3及FoxP3）表達(dá)水平均低于正常對照組和SLE組，表明AML患者體內(nèi)出現(xiàn)了免疫抑制現(xiàn)象。同時發(fā)現(xiàn)rhIL-2的刺激可上調(diào)AML患者PBMC中