Cereblon在慢性骨髓增殖性腫瘤中表達(dá)的臨床意義.pdf

1、目的:慢性骨髓增殖性腫瘤(cMPN)是一類造血干細(xì)胞起源的骨髓克隆性疾病，是一種惡性血液系統(tǒng)疾病。2008年，WHO論述的cMPN詳細(xì)列表中包括慢性粒細(xì)胞白血病(CML)、原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)、真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)、慢性中性粒細(xì)胞白血病(CNL)、慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血病/高嗜酸性粒細(xì)胞綜合征（CEL/HES）、肥大細(xì)胞病(MCD)以及未分類型MPN(cMPN-U)。而PV、ET和PMF患者中存在JA

2、K2基因V617F突變，此類疾病主要特點(diǎn)是骨髓一系或多系的髓細(xì)胞過度增殖而導(dǎo)致外周血中粒細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板的增多。共同臨床表現(xiàn)為血栓形成及出血、脾臟腫大、可轉(zhuǎn)化為髓系白血病，PV、ET患者亦有骨髓纖維化的傾向。免疫調(diào)節(jié)藥物(IMiDs)是多種惡性疾病治療方案的重要組成部分[1]，沙利度胺為IMiDs的代表性藥物，早期研究認(rèn)為其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及抗血管生成可能是致畸作用的機(jī)制[2，3]。近年來一項(xiàng)具有里程碑意義的研究發(fā)現(xiàn)cereblon(

3、CRBN)為沙利度胺致畸作用的重要靶點(diǎn)[4]。
　　E3蛋白酶復(fù)合體由CRBN、DDB1、ROC1、CUL4等構(gòu)成，為一種泛素化連接酶。此復(fù)合物在體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄[5、6、7]。CRBN為E3蛋白酶復(fù)合體的相關(guān)因子，其在體內(nèi)外均能發(fā)生泛素化作用[4]。有研究表明，沙利度胺的致畸作用是通過阻斷CRBN的泛素化實(shí)現(xiàn)的[8]，當(dāng)沙利度胺或者來那度胺發(fā)揮作用時(shí)，CRBN就不能形成E3復(fù)合物。沙利度胺及一些類似藥物，如來

4、那度胺和帕米磷酸鹽類藥物被廣泛應(yīng)用于慢性骨髓增殖性腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤及骨髓增生異常綜合征等惡性疾病的治療中[9]。有關(guān)于多發(fā)性骨髓瘤(MM)的研究表明CRBN為免疫調(diào)節(jié)藥物治療所必須，CRBN表達(dá)水平低的MM患者原發(fā)抗來那度胺[8、10]。且患者對(duì)沙利度胺維持治療的反應(yīng)與CRBN表達(dá)水平呈正相關(guān)性[11、121。然而目前有關(guān)CRBN的表達(dá)對(duì)于免疫調(diào)節(jié)劑治療慢性骨髓增殖性腫瘤的研究尚少。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)慢性骨髓增殖性腫瘤(PMF、PV、ET

5、)患者骨髓液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞(BM-MNCs)中CRBN mRNA表達(dá)水平，及外周血MNCs中CRBN蛋白表達(dá)水平，分析CRBN與慢性骨髓增殖性腫瘤與沙利度胺臨床療效的關(guān)系。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)收集了河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院首診cMPNs患者的骨髓液24例（其中MF5例、PV7例、ET12例），以及外周血7例（其中MF2例、PV2例、ET3例）設(shè)為初治組。經(jīng)口服沙利度胺50mg/d治療后的cMPNs患者的外周血11例設(shè)為治療組，其中連續(xù)口服6

6、個(gè)月以內(nèi)者為3例，6個(gè)月至12個(gè)月4例，口服時(shí)間超過12個(gè)月4例，并收集10例血液系統(tǒng)非惡性疾病患者骨髓液及外周血設(shè)為對(duì)照組。通過應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot的方法，檢測(cè)骨髓液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞(BM-MNCs)中cereblonmRNA、外周血MNCs中cereblon蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、cereblon mRNA的表達(dá)情況
　　RT-PCR結(jié)果顯示:初治組的24例cMPN患者單個(gè)核細(xì)胞

7、中CRBNmRNA的相對(duì)表達(dá)量為（1.0333±0.2723），其中初治MF、PV、ET患者CRBN mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.1814±0.2257）、（0.9943±0.3377）、（0.9943±0.2484），對(duì)照組CRBN mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.5699±0.9474）（見Fig.1、Tabel1）。所有cMPN患者的CRBN mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均升高，24例患者總表達(dá)量、MF患者表達(dá)量、PV患者表達(dá)量及ET患

8、者表達(dá)量與對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）;初治MF患者與初治PV患者CRBN mRNA的相對(duì)表達(dá)量相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.183)，初治MF患者與初治ET患者CRBN mRNA的相對(duì)表達(dá)量相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.144），初治PV患者與初治ET患者CRBN mRNA的相對(duì)表達(dá)量相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.100）（見Tabel1）;初治組24例患者中JAK2V617F突變陽(yáng)性13例，突變陰性11例， JAK2V617F突

9、變陽(yáng)性患者的CRBN mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.9743±0.2912），陰性為（1.1031±0.2427），兩組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.259)，兩組與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）（見Fig.2、Tabel2）。
　　2、cereblon蛋白表達(dá)情況
　　Western Blot結(jié)果顯示:初治組7例、治療組11例、對(duì)照組10例的cereblon蛋白表達(dá)量分別為（1.550±0.223）pg/ml、（1.0

10、28±0.182）pg/ml、（0.911±0.161）pg/ml（見Fig.3、Tabel3）。其中治療組中口服沙利度胺50mg/d連續(xù)6個(gè)月以內(nèi)者、6個(gè)月至12個(gè)月者，及大于12個(gè)月者的CRBN蛋白表達(dá)量分別為（1.181±0.133）pg/ml、（0.996±0.571）pg/ml、（0.945±0.248）pg/ml，隨著持續(xù)口服沙利度胺時(shí)間的增長(zhǎng)，CRBN蛋白表達(dá)量呈下降趨勢(shì)（見Fig.4、Tabel4）。所有cMPN患者CR

11、BN蛋白的表達(dá)量均升高，初治組與治療組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，初治組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，治療組CRBN蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組有升高趨勢(shì)，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.160)（見Tabel3）。將未服用沙利度胺治療的初治組患者7例設(shè)為1組，持續(xù)口服沙利度胺50mg/d治療6個(gè)月以內(nèi)的患者3例設(shè)為2組，持續(xù)治療6-12個(gè)月的患者4例設(shè)為3組，持續(xù)治療時(shí)間超過12個(gè)月的患者4例設(shè)為4組，正

12、常對(duì)照組10例設(shè)為5組，則1-5組的cereblon蛋白表達(dá)量分別為（1.550±0.223）pg/ml、（1.181±0.133）pg/ml、（0.996±0.571）pg/ml、（0.945±0.248）pg/ml、（0.911±0.161）pg/ml，各組之間CRBN蛋白的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，其中1組與2組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.007);與3、4、5組相比差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，2組與3、4組相比差異不具有

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.197、P=0.104)，與5組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034);3組與4、5組相比均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.697、P=0.435）;4、5組間相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.749）(見Tabel4)。
　　3、cereblon mRNA與cereblon蛋白表達(dá)的相關(guān)性
　　初治組中7例患者的cereblon mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.0000、1.1617、0.5428、1.132

14、7、1.1759、1.4321、0.8564，cereblon蛋白的表達(dá)水平分別為1.566 pg/ml、1.431 pg/ml、1.164 pg/ml、1.632 pg/ml、1.732pg/ml、1.849 pg/ml、1.479 pg/ml。Cereblon mRNA表達(dá)與cereblon蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.714，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)（見Fig.5）。
　　結(jié)論:
　　1、新診斷的慢性骨髓增