Cereblon在多發(fā)性骨髓瘤中表達(dá)的臨床意義.pdf

1、目的:多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是由漿細(xì)胞的惡性增殖引發(fā)的血液系統(tǒng)腫瘤，以貧血、腎功能損害、反復(fù)感染、溶骨性骨骼破壞等為臨床表現(xiàn)，多發(fā)生于中、老年人，男女比例無差異。免疫調(diào)節(jié)藥物是許多惡性血液病治療方案的基礎(chǔ)組成[1]，沙利度胺，最初是用為孕婦鎮(zhèn)靜劑，因?yàn)槠渲禄远裘阎Ｔ缙诘难芯空J(rèn)為沙利度胺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和抗血管生成，可能是其致畸性的作用機(jī)制[2，3]。近來在一個擁有里程碑意義的研究提出cereblon

2、(CRBN)是沙利度胺致畸的重要靶點(diǎn)[4]。
　　沙利度胺結(jié)合CRBN抑制E3泛素連接酶復(fù)合物（由CRBN，DDB1及CUL4構(gòu)成）的功能。這種復(fù)合物調(diào)節(jié)DNA修復(fù)，復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，沙利度胺通過抑制E3泛素連接酶復(fù)合物阻止在胚胎肢體發(fā)育非常重要的蛋白質(zhì)（例如下調(diào)成纖維細(xì)胞生長因子8）的降解導(dǎo)致致畸作用[4]。然而沙利度胺及其相關(guān)免疫調(diào)節(jié)藥物IMIDs的致畸作用是否與其抗骨髓瘤的作用有關(guān)，最近有研究表明，CRBN的表達(dá)是沙利度胺及其沙利

3、度胺衍生物—來那度胺及pomalidomide等抗骨髓瘤活性所必須的[5]。另外，還發(fā)現(xiàn)CRBN表達(dá)水平下降的MM患者原發(fā)抗來那度胺[5,6]。CRBN表達(dá)降低沒有影響MM患者對其它藥物，如硼替佐米，地塞米松和美法侖的反應(yīng)[4]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MM患者對沙利度胺的維持治療的反應(yīng)及對來那度胺結(jié)合地塞米松治療的反應(yīng)與CRBN的表達(dá)水平存在正相關(guān)[7，8]。此外，研究者們已經(jīng)觀察到復(fù)發(fā)和難治性患者CRBN基因突變，這支持在各種IMiDs治

4、療中CRBN起到關(guān)鍵作用[9]。然而，許多患者低CRBN水平都沒有明顯的突變，從而轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后因素（如調(diào)控的microRNA）可能會影響CRBN基因表達(dá)和對IMID治療的反應(yīng)能力[10]。
　　本實(shí)驗(yàn)通過檢測多發(fā)性骨髓癯患者骨髓單個核細(xì)胞(BM-MNCs)中CRBN mRNA及蛋白的表達(dá)水平，分析CRBN表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤及沙利度胺治療后臨床療效的關(guān)系。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR(Real Time F

5、luorescentQuantitative PCR, Real-Time QPCR)和Western Blot方法，收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院初次診斷的MM患者20例，設(shè)為初治組;經(jīng)治療后達(dá)到PR及以上者30例，設(shè)為緩解組。其中20例應(yīng)用沙利度胺50mg QD治療，8例應(yīng)用沙利度胺75mg QD治療，1例應(yīng)用沙利度胺100mg QD治療，1例口服沙利度胺200mg QD治療;收集20例正常志愿者外周血。應(yīng)用PT-PCR檢測各組單個核細(xì)胞

6、(BM-MNCs)中cereblon mRNA表達(dá)水平，應(yīng)用Western方法檢測細(xì)胞中cereblon蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、cereblon mRNA的表達(dá)情況
　　RT-PCR結(jié)果顯示:BM-MNCs中cereblon mRNA在初治組、緩解組、正常對照組的相對表達(dá)量分別是:(2.47±1.55)、(1.27±0.60)和(0.65±0.21)。所有MM患者cereblon mRNA的相對表達(dá)水平均

7、升高，與正常對照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000);治療后cereblon mRNA水平較初治組下降但仍高于正常對照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)。未口服過沙利度胺的患者20例設(shè)為1組，口服沙利度胺1-3個月的患者5例設(shè)為2組、4-6個月的患者6例設(shè)為3組、7-9個月的患者6例設(shè)為4組、10-12個月的患者7例設(shè)為5組及12個月以上者6例設(shè)為6組，各組CRBN mRNA相對表達(dá)量分別是(2.47±1.55)、(1.8

8、3±0.52)、(1.59±0.45)、(1.58±0.48)、(0.83±0.37)、(0.68±0.19)，各組間CRBN mRNA相對表達(dá)量呈下降趨勢，其中1組、2組、3組、4組及5組各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.053)，2組、3組、4組、5組、6組各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.299)1組與6組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.004)。
　　2、cereblon蛋白的表達(dá)情況
　　Western blot顯示:初治組、緩

9、解組、正常對照組的cereblon蛋白的含量分別是:(1.52±0.08) pg/ml、(1.09±0.06) pg/ml、(0.87±0.09) pg/ml。所有MM患者BM-MNCs中cereblon蛋白的含量均升高，與正常對照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.000）;緩解組cereblon蛋白水平下降，但仍高于正常對照組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)。未口服過沙利度胺的患者20例設(shè)為1組，口服沙利度胺1-3個月的患者5例

10、設(shè)為2組、4-6個月的患者6例設(shè)為3組、7-9個月的患者6例設(shè)為4組、10-12個月的患者7例設(shè)為5組及12個月以上者6例設(shè)為6組，各組CRBN蛋白相對表達(dá)量分別是(1.52±0.08) pg/ml、(1.17±0.08)pg/ml、(1.09±0.04) pg/ml、(1.09±0.02) pg/ml、(1.04±0.03) pg/ml、(1.03±0.03) pg/ml，各組間CRBN蛋白相對表達(dá)量呈下降趨勢，其中1組、2組、3組相

11、比各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)，，3組、4組、5組、6組各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.300)。
　　3、初治組治療療效與CRBN表達(dá)水平的關(guān)系
　　RT-PCR結(jié)果顯示:治療1個療程或多個療程達(dá)到PR及以上的初治患者治療前后CRBN mRNA相對表達(dá)量分別為(3.50±0.71)、(1.65±0.48)，未達(dá)到PR的初治患者其治療后CRBN mRNA相對表達(dá)量分別為(0.56±0.11)、(0.50±0.14)，正

12、常對照組BM-MNCs CRBN mRNA相對表達(dá)量為(0.64±0.20)。治療1個療程或多個療程達(dá)到PR及以上的初治患者CRBN mRNA相對表達(dá)水平明顯高于未達(dá)到PR患者的組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)，且明顯高于對照組，治療后基因水平下降，但仍高于正常對照組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)。未達(dá)到PR的患者CRBN mRNA相對表達(dá)水平在治療前后無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.733)，與正常對照組相比

13、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.733)。
　　Western blot顯示:治療1個療程或多個療程達(dá)到PR及以上的初治患者治療前后CRBN蛋白相對表達(dá)水平分別為(1.51±0.07) pg/ml、(1.10±0.07) pg/ml，未達(dá)到PR的初治患者其治療前后CRBN蛋白相對表達(dá)水平分別為(0.94±0.24)pg/ml、(0.88±0.22) pg/ml正常對照組BM-MNCs CRBN蛋白相對表達(dá)水平為(0.86±0.08) p

14、g/ml。治療1個療程或多個療程達(dá)到PR及以上的患者CRBN蛋白相對表達(dá)水平明顯高于未達(dá)到PR患者的組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)，且明顯高于正常對照組，治療后蛋白水平下降，仍高于對照組,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)。未達(dá)到PR的患者CRBN蛋白相對表達(dá)水平在治療前后無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.428)，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.428)。
　　結(jié)論:
　　1、新診斷的多發(fā)性骨