CDC20參與心肌肥大的臨床及基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的:
　　心肌肥厚增加了心律失常、心衰及死亡的幾率，而心肌肥厚發(fā)生發(fā)展機(jī)制卻十分復(fù)雜且并未明確。目前藥物治療心肌肥厚的作用并不理想，當(dāng)前研究抑制心肌肥厚甚至逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的藥物治療成為了主要研究方向。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)廣泛存在于心肌和全身組織中負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)80％-90％蛋白質(zhì)的降解并影響心肌重構(gòu)。目前研究已經(jīng)表明UPS系統(tǒng)在心肌肥厚形成過(guò)程中起到了相當(dāng)重要的作用，通過(guò)抑制部分蛋白酶體活性可抑制體外心肌細(xì)胞的肥大。因此我們假設(shè)

2、抑制作為泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)中一個(gè)重要組成部分的細(xì)胞周期分裂蛋白20(CDC20)同樣具有抑制心肌肥大的作用，從而明確CDC20在心肌重構(gòu)中的具體作用，為臨床治療心肌肥厚提供新的治療靶點(diǎn)及藥物治療的可能。
　　方法:
　　1.臨床心瓣膜病患者并開(kāi)胸接受心瓣膜置換手術(shù)切下心耳組織，收集心肌肥厚組及正常對(duì)照組心耳標(biāo)本各10例。蛋白質(zhì)印跡(western blot)測(cè)定兩組的CDC20水平。
　　2.選取SD大鼠出生2

3、4小時(shí)以內(nèi)的雄性乳鼠，提取乳鼠原代心肌細(xì)胞(NRCs)培養(yǎng)，將細(xì)胞隨機(jī)分成4組:對(duì)照組、苯腎上腺素(phenylephrine，PE)組、CDC20基因敲除組(siRNA-CDC20)、CDC20基因敲除組+PE組(siRNA-CDC20+PE)。用siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞并特異性敲除CDC20基因，苯腎上腺素(phenylephrinePE，30uM)刺激24小時(shí)。對(duì)各組進(jìn)行免疫熒光染色測(cè)定細(xì)胞肥大情況，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(quanti

4、tative real-time PCR，qPCR)檢測(cè)PE(30uM)刺激后肥大Marker(ANP、BNP、MHC)在4個(gè)組中的的表達(dá)量。提取組織總蛋白行聚丙烯酰氨凝膠電泳(western blot)檢測(cè)PE(30nM)刺激后各組CDC20表達(dá)水平的改變并檢測(cè)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)表達(dá)水平的改變。
　　3.選取SD大鼠出生24小時(shí)以內(nèi)的雄性乳鼠，提取乳鼠原代心肌細(xì)胞(NRCs)培養(yǎng)，將細(xì)胞隨機(jī)分成4組:對(duì)照組、苯腎上腺素

5、(phenylephrine，PE)組、CDC20過(guò)表達(dá)組(Ad-CDC20)、CDC20過(guò)表達(dá)+PE組(Ad-CDC20+PE)。用腺病毒感染心肌細(xì)胞并特異性過(guò)表達(dá)CDC20基因，苯腎上腺素(phenylephrinePE，30uM)刺激24小時(shí)。對(duì)各組進(jìn)行免疫熒光染色測(cè)定細(xì)胞肥大情況，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測(cè)PE(30uM)刺激后肥大Marker(ANP、BNP、MHC

6、)在4個(gè)組中的的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.心肌肥大組患者心耳細(xì)胞中CDC20蛋白的表達(dá)量高于非心肌肥大組。
　　2.大鼠原代心肌免疫熒光染色顯示:PE組細(xì)胞面積明顯大于對(duì)照組及CDC20基因敲除+PE組(P＜0.05)。
　　3.在新生大鼠乳鼠心肌細(xì)胞中，CDC20基因敲除+PE組(siRNA-CDC20+PE，30uM)中的肥大Marker(ANP、BNP、MHC)的mRNA的表達(dá)量小于PE組(P＜0.05

7、)。
　　4.PE可引起大鼠細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的ERK磷酸化表達(dá)量升高，CDC20基因敲除+PE組的表達(dá)量明顯小于PE組(P＜0.05)。
　　5.大鼠原代心肌免疫熒光染色顯示:CDC20過(guò)表達(dá)+PE組(Ad-CDC20+PE)細(xì)胞面積大于PE組及對(duì)照組(P＜0.05)，PE組細(xì)胞面積大于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.心肌肥大患者中的CDC20蛋白表達(dá)量增多。
　　2.大鼠原代心肌特異性敲除