HMGB1-TLR4-NF-ΚB信號(hào)通路在哮喘小鼠模型中的作用及維生素D的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、背景：哮喘是由基因和環(huán)境因素共同導(dǎo)致的常見(jiàn)呼吸道疾病，其發(fā)病機(jī)制、治療等諸多環(huán)節(jié)仍尚未完全清楚，因此探討哮喘發(fā)病機(jī)制、尋找新防治靶點(diǎn)仍然是研究的重要內(nèi)容。肺組織高遷移率族蛋白B1(high mobility group box1，HMGB1)是一種高度保守的核蛋白，可作為一種免疫調(diào)節(jié)因子和炎性因子參與氣道炎癥；Toll樣受體4（Toll like receptors4，TLR4）是一種重要的免疫識(shí)別受體，連接天然免疫和獲得性免疫，在啟動(dòng)

2、和調(diào)節(jié)氣道炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用。HMGB1可與 TLR4結(jié)合并相互作用，通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-kappa B，NF-KB)，引起下游的炎癥介質(zhì)釋放。維生素D既參與鈣磷代謝調(diào)節(jié)，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，主要通過(guò)影響單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞發(fā)揮廣譜的抗炎作用，并通過(guò)影響多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化參與氣道結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于維生素 D與哮喘的研究有一些報(bào)道，但具

3、體作用機(jī)制仍不明確。關(guān)于HMGB1、TLR-4在哮喘動(dòng)物肺組織的表達(dá)及維生素D的干預(yù)研究較少,而哮喘動(dòng)物外周血和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的表達(dá)研究更少，HMGB1/TLR4/NF-KB信號(hào)通路及維生素D的調(diào)控研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)建立哮喘小鼠模型，觀察肺組織病理學(xué)改變，BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類變化，外周血和BALF中HMGB1、TLR-4、IL-4和IFN-γ含量變化；肺組織HMGB1、TLR4和NF-KB mRNA和蛋白

4、的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討哮喘的發(fā)病機(jī)制。維生素D是一種生物制劑，副作用小，價(jià)格便宜，使用依從性好，與類固醇激素作用相似；本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用該藥進(jìn)行干預(yù)性試驗(yàn)，觀察其對(duì)HMGB1/TLR4/NF-KB信號(hào)通路及氣道炎癥和氣道重塑的影響，從新的角度詮釋其在哮喘防治中的作用，進(jìn)一步挖掘老藥的新用途，為臨床研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：不同劑量維生素D對(duì)哮喘小鼠肺組織HMGB1、TLR4表達(dá)的影響。
　　目的

5、：通過(guò)建立哮喘小鼠氣道重塑模型，觀察HMGB1及TLR4在肺組織的表達(dá),以及不同劑量維生素D對(duì)哮喘氣道重塑及HMGB1和TLR4表達(dá)的影響。
　　方法：50只BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、哮喘組、1,25-(OH)2D3低劑量組、1,25-(OH）2D3中劑量組和1,25-(OH)2D3高劑量組，每組10只。采用卵清蛋白(OVA)致敏建立哮喘模型，對(duì)照組以生理鹽水代替，然后給予1,25-(OH)2D3低、中、高三種劑量干預(yù)

6、，采用蘇木精-伊紅(HE)染色在光學(xué)顯微鏡高倍鏡視野（10×40）下觀察小鼠肺組織病理學(xué)變化，支氣管壁厚度的測(cè)定采用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行。采用免疫組化法觀察肺組織HMGB1及TLR4表達(dá)的變化，應(yīng)用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白的表達(dá)量。采用RT-PCR法檢測(cè) HMGB1及TLR4mRNA表達(dá)變化，基因的相對(duì)表達(dá)量按灰度值比值公式計(jì)算。
　　結(jié)果：⑴哮喘組小鼠出現(xiàn)流涕，打噴嚏，呼吸急促，咳嗽，點(diǎn)頭呼吸等哮喘樣表現(xiàn)，重者出現(xiàn)紫

7、紺，四肢癱軟；提示模型制作成功。⑵哮喘組小鼠氣道損傷明顯、可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞紊亂、脫落，氣道壁明顯增厚，管腔狹窄；1,25-(OH)2D3低、中劑量組支氣管壁結(jié)構(gòu)較哮喘組完整光滑，管腔狹窄和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較哮喘組減輕；但高劑量組較哮喘組氣道結(jié)構(gòu)破壞加重。⑶哮喘組小鼠氣道壁厚度較對(duì)照組明顯增加，1,25-(OH)2D3低、中劑量組氣道壁厚度較哮喘組明顯減輕(均 P＜0.05)，但高劑量組小鼠氣道壁厚度卻較哮喘組明顯增加(P＜0.

8、05)。⑷免疫組化結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠HMGB1和TLR4蛋白表達(dá)較弱；哮喘組小鼠HMGB1和TLR4表達(dá)較強(qiáng)，哮喘組較對(duì)照組HMGB1和TLR4表達(dá)明顯增高(均P＜0.05)；1,25-(OH)2D3低、中劑量組HMGB1及TLR4表達(dá)明顯低于哮喘組(均P＜0.05)，而高劑量組則明顯高于哮喘組(均P＜0.05)。⑸RT-PCR結(jié)果顯示:哮喘組HMGB1mRNA和TLR4 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增高；1,25-(OH)2D3低、中劑

9、量組HMGB1 mRNA和TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較哮喘組明顯降低(均P＜0.05)，而高劑量組則明顯高于哮喘組(均P＜0.05)。
　　結(jié)論：①在OVA致敏的哮喘氣道重塑模型中，HMGB1和TLR4表達(dá)明顯增高；②適量1,25-(OH)2D3可降低肺組織HMGB1和TLR4表達(dá)，減輕氣道重塑；過(guò)量則可能增加HMGB1和TLR4表達(dá)，加重氣道重塑；③適量1,25-(OH)2D3可能通過(guò)抑制HMGB1/TLR4信號(hào)通路,阻止下

10、游的炎癥因子釋放，改善哮喘氣道重塑。
　　第二部分：哮喘小鼠HMGB1/TLR4/NF-ΚB信號(hào)通路及維生素D的作用。
　　目的：觀察不同時(shí)間點(diǎn)哮喘小鼠病理學(xué)變化，BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類變化，外周血和BALF中HMGB1、TLR4、IL-4和IFN-γ含量變化，肺組織HMGB1、TLR4和NF-KB mRNA和蛋白表達(dá)變化，以及維生素D的干預(yù)作用。
　　方法：48只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、哮喘組和1,2

11、5-(OH)2D3干預(yù)組，每組小鼠為16只。霧化激發(fā)處理后，每組按兩個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)（1周和2周）進(jìn)行標(biāo)本處理，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取小鼠標(biāo)本8只。建立哮喘激發(fā)1周和2周動(dòng)物模型，同期采用中等劑量的1,25-(OH)2D3進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)。各組按不同時(shí)間點(diǎn)取小鼠右肺中葉進(jìn)行HE和免疫組化染色，觀察小鼠病理學(xué)變化，測(cè)定其氣道壁厚度，觀察HMGB1、TLR4和NF-KB在肺組織的表達(dá)部位。同時(shí)收集BALF和外周血，BALF進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測(cè)；采用酶聯(lián)免疫吸附法（

12、ELISA）測(cè)定BALF和外周血中HMGB1、TLR-4、IL-4和IFN-γ含量；采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR（Real-time PCR)和Western blot(蛋白質(zhì)印跡法）分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)HMGB1、TLR4和NF-KB表達(dá)變化，基因的相對(duì)表達(dá)量按2-△△Ct計(jì)算，蛋白的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)相對(duì)灰度值公式計(jì)算。
　　結(jié)果：⑴哮喘組1,2周氣道壁厚度和氣道損傷較對(duì)照組1,2周明顯增加（均P<0.05）；干預(yù)組1,2周較

13、哮喘組1,2周氣道壁厚度和氣道結(jié)構(gòu)破壞明顯減輕（均P<0.05）。⑵哮喘組1,2周與對(duì)照組1,2周比較，BALF中白細(xì)胞總數(shù)，嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例明顯升高，單核/巨噬細(xì)胞比例明顯下降（均P<0.05）；干預(yù)組1,2周與哮喘組1,2周比較，BALF中白細(xì)胞總數(shù)，嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例明顯下降，單核/巨噬細(xì)胞比例明顯上升（均P<0.05）。⑶哮喘組1,2周BALF中HMGB1、TLR4和IL-4含量均明顯高

14、于對(duì)照組1,2周，IFN-γ含量均明顯低于對(duì)照組1,2周（均P<0.05）；干預(yù)組1,2周BALF中TLR4和IL-4均明顯低于哮喘組1,2周，IFN-γ含量均明顯高于哮喘組1，2周（均P<0.05）；第1周時(shí)干預(yù)組BALF中HMGB1較哮喘組無(wú)變化（P>0.05），但第2周時(shí)干預(yù)組明顯低于哮喘組（P<0.05）。⑷哮喘組1,2周外周血中HMGB1和IL-4含量均明顯高于對(duì)照組1,2周，IFN-γ含量均明顯低于對(duì)照組1,2周，干預(yù)組1,

15、2周外周血中HMGB1和IL-4均明顯低于哮喘組1,2周，IFN-γ含量均明顯高于哮喘組1,2周（均P<0.05）；第1周時(shí)哮喘組外周血中TLR4含量與對(duì)照組比較無(wú)差異（P>0.05），但第2周時(shí)明顯高于對(duì)照組（P<0.05）；第1周時(shí)干預(yù)組外周血中TLR4含量與哮喘組比較無(wú)差異（P>0.05），但第2周時(shí)明顯低于哮喘組（P<0.05）。⑸哮喘組1,2周肺組織中HMGB1、TLR4、和NF-KB mRNA表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組1,2周；

16、干預(yù)組1,2周肺組織中TLR4和NF-KB mRNA表達(dá)量均明顯低于哮喘組1,2周（P均<0.05）。第1周時(shí)干預(yù)組HMGB1 mRNA與哮喘組比較無(wú)明顯差異（P>0.05），但在第2周時(shí)干預(yù)組則明顯下降（P<0.05）。⑹哮喘組1,2周肺組織中HMGB1、TLR4和NF-KB蛋白表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組1,2周；干預(yù)組1,2周肺組織中HMGB1、TLR4和NF-KB蛋白表達(dá)量均明顯低于哮喘組1,2周（均P<0.05）。⑺小鼠氣道壁厚度與

17、肺組織HMGB1、TLR4和NF-KB mRNA的表達(dá)量均呈正相關(guān)性（r分別為0.802，0.895，0.834；均P<0.05）；肺組織HMGB1、TLR4和NF-KB的mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)量間均呈正相關(guān)（r分別為0.871，0.841，0.823；均P<0.05）。⑻外周血中IL-4、IFN-γ與BALF中IL-4和IFN-γ濃度均呈正相關(guān)（r分別為0.600，0.743；均P<0.05）；外周血和BALF中IL-4濃度與HMG

18、B1、TLR4濃度間均呈正相關(guān)性（r1分別為0.696，0.331，r2分別為0.695，0.648；均P<0.05）。⑼BALF中HMGB1、TLR4含量分別與肺組織中HMGB1mRNA、TLR4mRNA,外周血HMGB1、TLR4含量分別與肺組織中HMGB1mRNA、TLR4mRNA間均呈正相關(guān)（r1分別為0.756，0.762，r2分別為0.762，0.327；均P<0.05）；HMGB1和TLR4含量在 BALF和外周血間均呈正

19、相關(guān)（r1為0.617，r2為0.325；均P<0.05）。⑽BALF中HMGB1和TLR4含量分別與細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例均呈正相關(guān)（r1分別為0.796，0.787，0.754，0.749； r2分別為0.730，0.698，0.558，0.480，均P<0.05）。
　　結(jié)論：①哮喘小鼠氣道重塑早期，肺組織高表達(dá)HMGB1、TLR4和NF-KB；②HMGB1和TLR4與氣道炎癥和免疫紊亂有關(guān)；適量1

20、,25-(OH)2D3可減輕氣道炎癥,可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡有關(guān)；③哮喘小鼠外周血和支氣管肺泡灌洗液中均高表達(dá)HMGB1和TLR4蛋白，適量1,25-(OH)2D3可以下調(diào)兩者的表達(dá)；④哮喘小鼠肺組織同時(shí)高表達(dá)HMGB1、TLR4和NF-KB的mRNA和蛋白，三者與氣道重塑相關(guān)，適量1,25-(OH)2D3可以下調(diào)三者的表達(dá)，改善氣道重塑；⑤HMGB1/TLR4/NF-KB信號(hào)通路在哮喘發(fā)病中起重要作用,適量1,25-(OH)