RNA干擾靶向沉默SPAG6基因?qū)θ薓DS細胞體內(nèi)外生長的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建靶向沉默SPAG6基因的pGC-SPAG6-shRNA重組慢病毒載體，從體內(nèi)外兩方面探討 SPAG6基因?qū)θ斯撬柙錾惓＞C合征（MDS）細胞生長的影響，明確SPAG6基因在MDS發(fā)生中的作用。
　　方法：
　　1、人 SPAG6基因 RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及驗證：以慢病毒pGC-GV-GFP為載體，設(shè)計并構(gòu)建3條針對SPAG6基因的shRNA慢病毒表達載體。轉(zhuǎn)染人MDS細胞株SKM-1細胞，利用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染

2、效率，qRT-PCR及Western blot驗證SPAG6基因的干擾效果，篩選最佳靶點。
　　2、SPAG6-shRNA慢病毒載體對SKM-1細胞生長的影響：利用qRT-PCR檢測 SPAG6在 SKM-1細胞中的表達情況，CCK-8法檢測SPAG6基因沉默對SKM-1細胞增殖活性的影響，流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡，并利用qRT-PCR及Western blot檢測部分凋亡相關(guān)分子的表達變化。
　　3、SPAG6-shR

3、NA慢病毒載體對SKM-1細胞生長影響的體內(nèi)研究：SPAG6-shRNA及NC-shRNA慢病毒載體穩(wěn)定感染SKM-1細胞，兩組細胞分別接種于免疫缺陷的 NOD/SCID小鼠皮下，建立 MDS荷瘤小鼠模型。觀察SPAG6基因干擾后移植瘤的生長情況，并利用TUNEL法檢測腫瘤組織的原位細胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1、SPAG6-shRNA慢病毒載體成功得到，流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率均在60％以上。QRT-PCR及Western

4、blot結(jié)果顯示SPAG6-shRNA3慢病毒載體的敲除效率最高，為最佳靶點。
　　2、SPAG6在SKM-1細胞中表達明顯增高，靶向沉默SPAG6基因后，SKM-1細胞的生長受抑，OD值較陰性對照組相比降低（P<0.05）。干擾組細胞的凋亡比例為(16.42±3.27)%，明顯高于對照組[(4.12±0.52)%，P=0.024]，而兩組間的細胞周期并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。另外，SPAG6干擾組細胞內(nèi)caspase3

5、、caspase8、 caspase9及p53的表達水平明顯增高。
　　3、在NOD/SCID小鼠皮下成功建立SKM-1細胞移植瘤，SPAG6干擾組瘤塊的體積及重量均小于對照組，并且TUNEL法結(jié)果顯示干擾組瘤塊組織的原位細胞凋亡率明顯高于對照組（ SPAG6-shRNA48.33±2.52% vs. NC-shRNA18.33±3.51%,P=0.000）。
　　結(jié)論：
　　SPAG6-shRNA慢病毒載體成功構(gòu)建，