Jab1基因靶向RNA干擾對喉癌生長抑制的實驗研究.pdf

1、喉鱗狀細(xì)胞癌(Laryngeal Squamous Cell Carcinoma,LSCC)和其它腫瘤一樣,是一種多基因性、多步驟、多階段的發(fā)生過程,發(fā)病機制復(fù)雜,治療困難。目前,喉癌治療以手術(shù)切除或放療為主,盡管取得了較大進(jìn)展,但手術(shù)致殘率高、并發(fā)癥多,常規(guī)放療的毒副作用大,療效差,特別是晚期腫瘤病人,轉(zhuǎn)移率高,病人生存率低。因此,急需尋找有效、簡便的治療方法。隨著喉癌相關(guān)基因及分子生物學(xué)研究的發(fā)展,喉癌基因治療的相關(guān)研究也在不斷深入

2、。
　　 對腫瘤相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯等水平特異性的阻斷能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向成熟方向轉(zhuǎn)化或凋亡。RNA干擾((RNA interference,RNAi)現(xiàn)象廣泛存在于各種生物體中,能夠在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生特異性的基因沉默,在后基因組研究中得到廣泛應(yīng)用,是分子靶向抗癌治療的分子學(xué)基礎(chǔ)。最近,RNA干擾作為一種抗癌治療的方法已經(jīng)進(jìn)入實驗階段,預(yù)計將發(fā)展成為一種基因治療的藥物。
　　 Jab1(C-Jun activat

3、ion domain-binding protein1)位于COP9(COP9signalosome,CSN)信號復(fù)合體的第五亞單位,早期研究證明Jab1是c-Jun激活區(qū)的輔助激活因子,后來研究發(fā)現(xiàn) Jab1也是激活蛋白-1(activator protein1,AP-1)的輔助因子,最近研究證實Jab1和多種蛋白的出核轉(zhuǎn)運降解有關(guān),例如p27kip1(kinase inhibit protein1,P27)、P53、Smad4。Ja

4、b1作為一個潛在的致癌基因在多種腫瘤疾病的發(fā)展中起著調(diào)節(jié)器的作用。
　　 P27是細(xì)胞周期素依賴的激酶抑制因子,通常在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生作用,Jab1可以與P27發(fā)生作用并改變其細(xì)胞定位使其出核降解,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖,Jab1與P27在各種腫瘤細(xì)胞的研究中表明存在負(fù)相關(guān)性。
　　 在我們前期的實驗中發(fā)現(xiàn)Jab1在人類喉癌細(xì)胞中高表達(dá),與P27的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性,并利用RNAi技術(shù)沉默喉癌細(xì)胞中活躍的癌基因Jab1的表達(dá)

5、,通過RT-PCR、流式細(xì)胞學(xué)、MTT的方法檢測到其能達(dá)到阻止或減緩腫瘤細(xì)胞生長的目的。在本研究中,我們通過應(yīng)用RNA干擾技術(shù)來研究Jab1的低表達(dá)對喉癌細(xì)胞的細(xì)胞株(Hep-2細(xì)胞)在體外增殖的影響,使用一系列的干擾方式,例如,短發(fā)夾施工干擾 RNA(shRNA)的質(zhì)粒和非特異性質(zhì)粒抑制Jab1的表達(dá),通過WST-8檢測細(xì)胞增殖的能力,通過 Western Blotting檢測基因的表達(dá)。為了觀察shRNA質(zhì)粒在體內(nèi)引起Jab1的下調(diào)

6、對腫瘤生長的影響,我們將Hep-2腫瘤細(xì)胞在裸鼠皮下注射建立人喉癌異種移植瘤模型。模型建立后經(jīng)與Jab1shRNA質(zhì)粒和對照組治療,腫瘤的生長受到了抑制。這些結(jié)果為人類喉癌治療提供了新的實驗數(shù)據(jù)。
　　 本實驗共分為兩個部分:
　　 第一部分 Jab1靶向shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及其對喉癌細(xì)胞Hep-2目的基因沉默效應(yīng)的研究
　　 目的:利用RNA干擾技術(shù),構(gòu)建Jab1基因靶向shRNA質(zhì)粒,觀察目的基因的沉默效應(yīng)及

7、對Hep-2腫瘤細(xì)胞的影響。
　　 方法：設(shè)計合成以Jab1基因為靶向目標(biāo)的shRNA,將其定向克隆到真核表達(dá)載體pGenesill.1中形成重組質(zhì)粒；利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人喉癌細(xì)胞株(Hep-2),通過WST-8、Western Blotting的方法對細(xì)胞凋亡及蛋白水平的表達(dá)變化進(jìn)行檢測,分析shRNA干擾質(zhì)粒對喉癌細(xì)胞的影響。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了Jab1基因靶向的pJab1以及陰性對照pKB真核重組

8、質(zhì)粒。WST-8結(jié)果示pJab1重組質(zhì)粒能顯著抑制Hep-2細(xì)胞的增殖活性,與對照組相比,顯著差異(p<0.001)。Western Blotting結(jié)果示Hep-2-pJab1細(xì)胞Jab1蛋白表達(dá)量明顯降低,P27蛋白表達(dá)量明顯升高,與對照組相比,差異顯著(p<0.001)。
　　 結(jié)論：構(gòu)建靶向Jab1癌基因的shRNA干擾質(zhì)粒能夠下調(diào)Jab1基因的表達(dá),上調(diào)p27基因的表達(dá),抑制人喉癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞在體外的增殖。

9、r>　　 第二部分Jab1基因沉默對裸鼠人喉癌移植瘤生長影響的實驗研究
　　 目的:探討Jab1重組質(zhì)粒對人喉癌Hep-2細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響。
　　 方法：建立了喉癌Hep-2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型,通過瘤體內(nèi)注射pJab1,pKB,PBS,觀察瘤體增長情況,通過免疫組化方法、RT-PCR、Western Blotting等觀察瘤體內(nèi)Jab1、P27的mRNA水平及蛋白水平的變化。
　　 結(jié)果：成功建立喉

10、癌Hep-2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型；pJab1質(zhì)粒組的腫瘤體積為(267.60±88.19)mm3,瘤重為(0.49±0.03)g,顯著低于錯意序列對照組和空白對照組；免疫組化結(jié)果顯示實驗組瘤內(nèi)的Jab1蛋白的表達(dá)水平降低,顯著低于對照組,P27蛋白的表達(dá)水平增高,顯著高于對照組；RT-PCR結(jié)果顯示實驗組瘤內(nèi)Jab1的mRNA水平顯著降低,P27的mRNA無明顯變化；WesternBlotting結(jié)果顯示實驗組瘤內(nèi)Jab1蛋白表達(dá)量明