BclGs與JAB1的相互作用及其對細胞凋亡的調(diào)控研究.pdf

1、B c lG s 與J A B I的 相互作用及其對細胞凋亡的 調(diào)控研究摘 要B c l 一 2 家族蛋白 是線粒體凋亡通路的關鍵調(diào)節(jié)分子， 其中 僅含有B H 3 結(jié)構(gòu)域的促凋亡 成員B c l G s ( B c l 一 G o n a d s h o r t f o r m) 在人的 翠丸中 特異 性高表 達， B c I G s 過表達可以B H 3結(jié)構(gòu)域依賴的方式誘導細胞凋亡， 但其中的分子機制還不清楚. 本研究運用w es

2、t e mb l o t 、免疫共沉淀、 亞細胞定位、 流式細胞檢測、 線粒體分離與純化以 及細胞凋亡檢測等實驗技術體系揭示了B d G s 的促凋 亡信號轉(zhuǎn)導機制，同時 鑒定了J A B I 為B d G s 的一個新結(jié)合蛋白， 確認了 它們的 相互作用結(jié)合區(qū) 域， 進而探討了B c l G s 與J A B I 的相互作用對細胞凋亡的調(diào)控作用及其機理。 得到以 下結(jié)果:( 1 ) 將B c l G s 過表達H e L a 細胞 3

3、 6 h 后， W 己 s t emb l o t實驗檢測細胞總蛋白 發(fā)現(xiàn)B c l G s 的過表達可以 誘導促凋亡蛋白B a x 的表達上調(diào); 進而分離過表達 B c l G s 細胞的線粒體和胞漿蛋白， 分別檢測了 線粒體和胞漿中的 B a x 和細胞色素 c的蛋白 水平，發(fā)現(xiàn)B d G s 的過表達可以 導致線粒體中B a x 量的增加， 與此同時胞漿中的B a x 量減少; 另外，線粒體中的 細胞色素 c 的 量減少， 而胞漿

4、中的細胞色素c 增加;同 時發(fā)現(xiàn)， B d G s 的 過表達可以 誘導c a s p a s e 一 3 的 激活，過表達B c l G s 的 細胞中 添加終濃 度2 0林 Mc a s Pa s e 抑制劑2 一 V A D 一 F M K可以 抑制B c l G s 所誘導的細胞凋亡， 這些現(xiàn)象表明B c l G s 所誘導的細胞凋亡依賴典型的線粒體凋亡通路。( 2) 同時為了 研究B c l G s 的相互作用蛋白 及其調(diào)控機

5、理， 本研究運用酵母雙雜交技術從人的皋丸c D N A 文庫中 篩選出B c l G s 的一個新結(jié)合蛋白J A B I ， 免疫共沉淀和G S TP un 一 d o w n 實 驗確 認兩者在 體內(nèi) 體 外均有相互 作用。 構(gòu)建了B d G s 的 三個N端缺失 體和三個C端缺失體與全長 J A B I 進行免疫共沉淀實驗， 結(jié)果表明: B c l G s 的 缺失C 末端不同片段的三個缺失體與J A B I 全長均有相互作用， 而

6、B c l G s 的 缺失N末端不同片 段的三個缺失體與J A B I 全長則沒有相互作用， 證明B c l G s 的N末端 1 一 6 7 位氨基酸對于這種相互作用是必須的; 細胞定位實驗顯示， 單獨過表達的B c l G s 點 狀分布于胞漿中， 單獨過表達的J A B I 主要均勻分布于胞漿，同時胞核中也有少量分布; B c l G s 與J A B I 共表達后兩者在胞漿中共定 位。( 3 ) 為了 研究B c l G s

7、與J A B I 相互作用 對細胞凋 亡的 影響， 本研究 進而用流式細胞技術分別 檢測了 過 表達B c l G s 和J A B I 的 細胞周期S u b一 G l 期; 用A n e x i nv - P E 和7 一 A A D雙標記技術分別對細胞膜和細胞核進行標記， 進而流式檢測細胞凋亡; 同時也從凋亡細胞形態(tài)學觀察實驗對細胞凋亡的影響進行了 研究;發(fā)現(xiàn)B d G s 與J A B I 的 相互作用可以 協(xié)同 誘導細胞凋亡;

8、 J A B I 單獨過表達對細胞無凋亡效應， B c l G s 單獨過表達對細胞具有明顯的促凋亡效應， 而J A B I 與 B d G s 的 共表達可顯著加速細胞凋亡。 免疫共沉S T UDYOFT HEI NT E R AC T I ONB E T 丫 V E E NB CL GSANDJ ABl ANDI T SROL EI NT HERE GUL A T I 0N0FAP OP T OS I SABS TRACTT h e

9、 B c l 一 2 f a m i l y m e m b e r s a r e t h e k e y r e g ul a t o r s o f c e l l a p o P t o s i s a tt h e m i t o c h o n 面al e v e l . T he B H 3 一 o n l y P r o 一 a P o P t ot i c m e m b e r B c l G s ( B c l 一

10、 G o n a ds h or t f o r m) w a s u ni q ue a l no n gt h ef a m i l y d u e t o i t s h i g h l y s P e c i f i c e x P r e s s i o n i n h u ma nt e s t i s a nd h a sb e e n d e m o n s t r a te d t oi n d u c e a p o

11、 P t o s i s d e P e n d e n to f t h e B H 3 d o m a i n . H o w ev e r ， t h e m e c h 耐s mo f B c l G s i n d u c e da p o P t o s i s i s s t i l l u nc l e a r . I nt h i s s 1 u d y ，w e f o u n dt h e r o l eo f B

12、 c l G s i n d u c e da po P t o s i sM o r e o v e r ，w e i d e n t i f i e dJ A B l a s an ov e l B c l G s 一 s P e c i f i cb i n d i n gP r o t e i nt h r o u g ha y e a s tt w o 一 h y b r i d s c r e e n i n g i n a

13、 h l l n 1 a n t e s t is c D N Al i b r a r yF u r t h e r mo r e ， o u rs t u d y e l u c i d a t ed t h ei n t e r a ct i o n b e t w e e n B c l G s a nd J A B l a n d i t s r o I e i n t h e r e g u l a t i o n o f

14、a po P t o s i s ·( 1 ) H e L a c e l l s w e r et r a n s f e c t e d w i t h B c l G s . T he e x P r e s s i o n l e v e l o f B a x i n t o t a l c e l lI y s a t e d e t e c t e d b ywe s t e m b l o t . B a x

15、e x Pr e s s i o n w as u P r e g ul a t e d i n c e l l s w h e nB c l G s w aso v e r e x P r e s s e d . M o r e o v e r ， B a x t r a n s l o c a t i o n f r omc y t o s o l 田 l d m i t o c h o n d r i a w a s a l s

16、o a na 】 y Z e d .C y t o s o l i c a n d m i t o c h o n dr i a lP r o t e i n s w er ee x t r a c t e d f r omH e L a c e l l s t r a n s f e c t e d w it h B c l G sa n d B a x a n d c y t O c h r o m e c e xP r e s s

17、 i o n w a sa na l y z e d b y w es t e mb l o t . I t w a ss h o w n t h a t B a xl e v e l i n c r e a s e d i n m i t oc h o n dr i a a n d d e c r e a s e d i n c y t o s o l 丘 a c t i o n s i n c e l l s t r a n s f

18、 e c t e d w it hB c l G s . A c c o r d i n g l y ; w e e x a mi n e d t h ed i s t r i b u t i o no fc y t o c h r o m eci nc y t o s o la nd而t o c h o n d r i aT h e r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c f r Om而t o

19、c h o n dr i a i n to t h e c y t o s o l a l s o o c c u r e di nr e s P o n s et oB c l G s o v e r e x P r e s s i o n . I no r d e r t o i n ve s t i g a t e w h e t h e r B c l G s 一 i n d uc e dc e l la po P t o s

20、i s a c t i v a t e d c a s P a s e s . C a s P a s e 一 3 a c t i v a t i o n i n H e L a c e l l s w a sa na 1 y z e d b y w es t e mb l o t .C l e a va g e o f c a s P a s e 一 3 w a sc l e a r l y o b s e r v e d i n H

21、 e L a c e l I s t r a I 1 s f e c t e d 幼t hB c l G s T he g e n e r a lc a s P a s e i n h ib i t o r z 一 V A D 一 F M Kc o u l d a b r o g a t e B c l G s 一 i n d u c e d a p o P t o s i s .( 2 ) M o r e o ve r ， w e i

22、 d e n t i f i e d J A B l a sa n o v e l B c l G s 一 S P e c i f i c b i n d i n g P r o t e i n t h ro u g h ay e a s t t w o一 h y b r i d s c r e e n i 飛 i n a h u ma nt o s t i s c D N Al i b r a r y . A n a n a l y

23、s i s o f B c l G s d e l e t i o nc o n s t r u c t s s h o w e dt h a tN 一 t e r mi n a l d e l e t e dB c l G sm u 1 a l 1 t s c o u l dn 0 t i n i e r a c t w i t hJ A B l ，w he r e a s C . t e n 1 1 i n a l d e l e

24、t e d B c l G s m u t a n t s c o u l d . o u r s t ud y s h o w ed t h a tN 一 t e r mi n a l l 一 6 7a m i n o a c i d s o f B c l G s w e r er e q u i r e d f o r t h is i n t e r a c t i o n . W e a l s o d e m o n s t

25、 r a t e d t h a tB c l G s w a sm a i u l y l o c a l i z e d i n t h e c y t o P l a s m ， w h e r e a sJ A B l m a i n l y i n t h e c y t oP l a s ma nd P a r ti a l l y i n t h en u c l e u sw h e no v e r e x P r e