Sirt1與c-Myc的相互作用及其在腫瘤細(xì)胞增殖中的研究.pdf

1、Sirt1是酵母染色質(zhì)沉默因子(Silent information regulator 2，Sir2)的哺乳動(dòng)物同源體，屬于Ⅲ類(lèi)組蛋白去乙?；?。Ⅲ類(lèi)組蛋白去乙?；竻⑴c的反應(yīng)依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamid adenine dinucleotide)，這不同于Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)組蛋白去乙?；?。Sir2家族的蛋白從細(xì)菌到人類(lèi)都具有高度保守性，人Sirtuins是與Sir2具有同源性的一個(gè)家族，其中Sirt1是與Sir2同源

2、性最高的一個(gè)成員，在許多生命過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)、重組、長(zhǎng)壽和基因沉默中都發(fā)揮了重要的作用。近年來(lái)的研究表明，Sirt1不僅可以去乙酰化組蛋白如組蛋白H3、H4等，而且與很多轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔因子相互作用，調(diào)節(jié)它們的轉(zhuǎn)錄激活作用。這些轉(zhuǎn)錄因子包括：p53、FOXO家族、NF-κB(p65)、MyoD等；轉(zhuǎn)錄輔因子包括：NcoR、p300、PGC-1α等。
　　 原癌蛋白c-Myc/Max復(fù)合物是由結(jié)構(gòu)功能相關(guān)

3、的亞家族亞單位組成的二聚體。這些成員均有進(jìn)化保守的亮氨酸拉鏈(leucirie zipper)又稱(chēng)堿性拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域。c-Myc/Max復(fù)合物對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、代謝、腫瘤發(fā)生等生理或病理信號(hào)發(fā)生應(yīng)答，通過(guò)bZIP結(jié)構(gòu)域的堿性區(qū)域與DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。c-Myc的活性調(diào)節(jié)是通過(guò)多方面來(lái)完成的，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯后修飾、c-Myc/Max復(fù)合物的二聚化及和其他輔助蛋白的相互作用調(diào)節(jié)。Sirt1與c-Myc間的相互作用可能

4、為揭示Sirt1在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用提供線索。
　　 我們通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析到在Sirt1的啟動(dòng)子區(qū)有c-Myc的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)在p53缺失的K562、H1299和p53突變的MDA-MB-231細(xì)胞中過(guò)表達(dá)c-Myc，檢測(cè)到Sirt1 mRNA和蛋白水平的上調(diào)，ChIP的方法鑒定了c-Myc在Sirt1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，而在p53表達(dá)的HeLa和293A中未檢測(cè)到c-Myc對(duì)Sirt1的上調(diào)和c-Myc在Sirt啟動(dòng)子區(qū)

5、的結(jié)合。然后我們通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和EMSA確定了c-Myc結(jié)合在Sirt1啟動(dòng)子的E-box2區(qū)。
　　 另一方面我們通過(guò)免疫共沉淀和GST-pulldown的方法確定了Sirt1與c-Myc的相互作用及具體的介導(dǎo)相互作用的結(jié)構(gòu)域。同時(shí)通過(guò)IP和Western blot確定Sirt1作為去乙酰化酶能夠抑制c-Myc的乙酰化水平。在HeLa和293A細(xì)胞中通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)了Sirt1的過(guò)表達(dá)在基礎(chǔ)水平能夠促進(jìn)c-My

6、c的轉(zhuǎn)錄活性。為了說(shuō)明Sirt1是如何促進(jìn)c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性的，我們?cè)贙562中敲低Sirt1的表達(dá)量，檢測(cè)c-Myc的蛋白量，結(jié)果顯示Sirt1對(duì)c-Myc的蛋白量沒(méi)有明顯改變。在293A細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Sirt1后也沒(méi)有檢測(cè)到外源過(guò)表達(dá)的c-Myc的蛋白量的改變，說(shuō)明Sirt1對(duì)c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性的影響不通過(guò)影響其蛋白穩(wěn)定性。于是我們檢測(cè)了Sirt1是否影響c-Myc與Max二聚體的形成。通過(guò)Co-IP的方法發(fā)現(xiàn)Sirt1能夠增強(qiáng)c

7、-Myc與Max的結(jié)合。接著我們?cè)贙562、MDA-MB-231細(xì)胞中敲低Sirt1的量或過(guò)表達(dá)Sirt1，用Realtime-PCR的方法檢測(cè)到Sirt1能夠促進(jìn)c-Myc的下游靶基因hTERT、cyclinD2、LDHA的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)檢測(cè)到Sirt1干擾的K562細(xì)胞中c-Myc在hTERT的啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合減弱，與Sirt1能夠增強(qiáng)c-Myc與Max的結(jié)合的結(jié)果一致。最后我們通過(guò)MTT和流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)Sirt1的干擾能夠抑制K562