人類yrdC基因靶向RNA干擾抑制胃癌生長的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 檢測胃癌組織及癌旁正常組織中的yrdC的mRNA、蛋白表達(dá)，構(gòu)建和鑒定yrdC靶向RNA干擾重組腺病毒，觀察其對胃癌BGC-823細(xì)胞體外及體內(nèi)生物學(xué)特性的影響。 方法 采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot法，檢測7例胃癌組織及癌旁正常組織中的yrdC mRNA、蛋白表達(dá)。構(gòu)建vrdC靶向RNA干擾重組腺病毒Ad-SnyrdC，將其轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823細(xì)胞，應(yīng)甩Westen

2、-blot檢測yrdC蛋白表達(dá)變化，繪制細(xì)胞生長曲線，MTT比色法測定BGC-823細(xì)胞增殖的變化。裸鼠隨機(jī)分為3組，背部皮下分別注射未轉(zhuǎn)染的及Ad-Null和Ad-shyrdC轉(zhuǎn)染的BGC-8232胞，30d后測量腫瘤體積及重量，HE染色及yrdC、FVⅢ因子、VEGF、PCNA、TUNEL免疫組化染色。 結(jié)果 胃癌組織中yrdC mRNA及蛋白表達(dá)量均比癌旁組織增高。成功構(gòu)建了yrdC靶向RNA干擾重組腺病毒；轉(zhuǎn)染B

3、GC-823細(xì)胞后明顯抑制其增殖活性，與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染Ad-Null組均有顯著差異(P<0.05)；接種裸鼠后30d后，RNA干擾組與對照組腫瘤體積及重量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，RNA干擾組腫瘤HE染色可見出現(xiàn)多處出血和片狀壞死，免疫組化染色顯示：RNA干擾組微血管密度明顯少于對照組，VEGF、yrdC蛋白表達(dá)明顯少于對照組，細(xì)胞凋亡增加，PCNA標(biāo)記指數(shù)明顯低f于對照組。 結(jié)論 胃癌組織中蛋白水平及mRNA

4、水平y(tǒng)rdC均呈高表達(dá)，yrdC基因靶向RNA干擾體外及體內(nèi)有明顯抑制胃癌細(xì)胞生長的作用，該基因可能成為胃癌基因治療的一個(gè)靶點(diǎn)。 胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)，胃癌在腫瘤死亡率中居第二位。在我國衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)九十年代我國惡性腫瘤死亡率排名第一位為胃惡性腫瘤，其病因和發(fā)病機(jī)制未完全闡明，不能進(jìn)行針對性治療，因此探索新的更為理想的治療方法，長期以來是胃惡性腫瘤治療研究的努力方向。 本研究分別從體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)兩方面研究

5、采用RNA干擾技術(shù)抑制yrdC表達(dá)后對胃癌BGC-823細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響，探討RNA干擾在胃癌治療中的意義，為進(jìn)一步開展臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容、方法和結(jié)果如下： 第一部分 yrdC在胃癌中的表達(dá) [目的] 檢測胃癌組織及癌旁正常組織中的yrdC的mRNA、蛋白表達(dá)。 [方法] 采用逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westem blot法，檢測7例胃癌組織及癌旁正常組織中的yrdC的mRNA

6、、蛋白表達(dá)。 [結(jié)果] 胃癌組織中yrdC mRNA及蛋白表達(dá)量比癌旁組織增高。經(jīng)圖像分析儀掃描RT-PCR電泳圖獲得條帶灰度值，胃癌組織中yrdC mRNA灰度掃描值為216.3±36.4，癌旁組織中yrdC mRNA灰度掃描值為74.1±7.0，癌組織中mRNA豐度顯著高于癌旁組織(P<0.01)。經(jīng)圖像分析儀掃描Westernblot獲得條帶灰度值，胃癌組織中yrdC蛋白條帶灰度掃描值為 1005.2±145.9，癌旁組織

7、中yrdC蛋白灰度掃描值為298.4±22.8，癌組織中yrdC蛋白表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.01) [結(jié)論] 胃癌組織中蛋白水平及mRNA水平y(tǒng)rdC均呈高表達(dá)，因此以yrdC為靶點(diǎn)，阻斷其表達(dá)治療胃癌在理論上是可能的。 第二部分 yrdC靶向RNA干擾重組腺病毒的制備與鑒定 [目的] 制備與鑒定攜帶yrdC shRNA的重組腺病毒。 [方法] 以計(jì)算機(jī)軟件輔助設(shè)計(jì)RNA干擾位點(diǎn)，經(jīng)篩選位點(diǎn)后PCR

8、法擴(kuò)增，并雙酶切將其插入pShuttle-H1中構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttleH1-shyrdC，經(jīng)酶切線性化后采用電穿孔法將其與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1一起轉(zhuǎn)化到BJ5183大腸桿菌電感受態(tài)細(xì)菌中，挑選同源重組質(zhì)粒，酶切線性化后利用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝成重組腺病毒顆粒，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)現(xiàn)象，收集細(xì)胞反復(fù)凍融、裂解，獲得高滴度重組腺病毒。 [結(jié)果] 成功地制備了高滴度攜帶yrdCshRNA的

9、重組腺病毒。 [結(jié)論] 采用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)能夠構(gòu)建攜帶yrdCshRNA的重組腺病毒，為下一步轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞以研究yrdC靶向RNA干擾的作用奠定了基礎(chǔ)。 第三部分 yrdC靶向RNA干擾對體外培養(yǎng)的BGC-823細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 [目的] 研究yrdC靶向RNA干擾對體外培養(yǎng)的BGC-823細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 [方法] 重組腺病毒Ad-shyrdC轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞。Wes

10、tern blot檢測干擾后BGC-823細(xì)胞yrdC蛋白水平，同時(shí)采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT法觀察Ad-shyrdC轉(zhuǎn)染對胃癌細(xì)胞生長的影響。 [結(jié)果] 腺病毒介導(dǎo)的yrdC靶向RNA干擾能特異性抑制BGC-823中yrdC蛋白的表達(dá)，RNA干擾組腫瘤細(xì)胞yrdC蛋白水平明顯下降。轉(zhuǎn)染Ad-NuU組的BGC-823細(xì)胞生長曲線與未轉(zhuǎn)染組基本相似，二者無顯著性差異(P>0.05)；RNA干擾組BGC-823細(xì)胞生長明顯受抑制，從48h

11、后開始其細(xì)胞數(shù)與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染Ad-Null組均有差異(P<0.05)；轉(zhuǎn)染Ad-Null組細(xì)胞MTT值與未轉(zhuǎn)染組無顯著性差異(P>0.05)；RNA干擾組細(xì)胞MTT值明顯低于轉(zhuǎn)染 Ad-Null組和未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。 [結(jié)論] RNA干擾組BGC-823細(xì)胞yrdC表達(dá)明顯降低，細(xì)胞增殖速度較Ad-Null轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組明顯減慢，提示靶向干擾yrdC蛋白表達(dá)能在體外抑制胃癌細(xì)胞增殖。 第四部分RNA干擾yrd

12、C沉默影響B(tài)GC-823細(xì)胞生物學(xué)特性的體內(nèi)研究 [目的] 研究yrdC靶向RNA干擾對BGC-823細(xì)胞體內(nèi)生物學(xué)特性的影響 [方法] 實(shí)驗(yàn)裸鼠隨機(jī)分為3組。在裸鼠背部皮下分別注射Ad-Null轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞和Ad-shyrdC轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞各1×10<'7>cell/只，PBS處理BGC-823細(xì)胞對照。接種30d后測量形成腫瘤的長度(L)和寬度(W)，依據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積V=0.4×L×W<'2>。

13、處死小鼠，取出瘤體稱重，常規(guī)病理切片HE染色，yrdC、FVⅢ因子、VEGF、PCNA、TUNEL免疫組化染色。 [結(jié)果] 3 組細(xì)胞接種裸鼠后約7d，可見裸鼠背部腫塊產(chǎn)生。接種30d后，正常BGC-823細(xì)胞、Ad-Null轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞和Ad-shyrdC轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞3組瘤體積分別為596.1±74.5mm<'3>，671.3±44.1mm<'3>，362.4±54.0mm<'3>，質(zhì)量分別為385.9±4

14、9.2mg，451.7±23.1mg，255.3±32.6mg，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，Ad-shyrdC轉(zhuǎn)染細(xì)胞組與正常BGC-823細(xì)胞和Ad-Null轉(zhuǎn)染細(xì)胞組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HE染色RNA干擾組腫瘤有多處出血和片狀壞死，未轉(zhuǎn)染組裸鼠種植瘤細(xì)胞胞核明顯增大，見不規(guī)則核分裂像，細(xì)胞呈現(xiàn)惡性增殖的特點(diǎn)，部分切片可發(fā)現(xiàn)腫瘤圍繞血管簇狀生長；免疫組化染色顯示RNA干擾組yrdC陽性表達(dá)率較對照組明顯降低；FVⅢ因子染色顯示RNA干