黃藥子抑制胃癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胃癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，2008年全球新發(fā)胃癌患者近99萬(wàn)例，占全部新發(fā)癌癥病例8％，死亡近74萬(wàn)，占全部死亡病例10％。目前，在世界范圍內(nèi)GC占腫瘤死亡率的第2位，僅次于肺癌。流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，我國(guó)胃癌的發(fā)病率2000年居第三位，2004～2007年上升至第二位。2010年中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒報(bào)告，我國(guó)胃癌年死亡率為23.10/10萬(wàn)，是世界平均水平的2倍多。胃癌已成為嚴(yán)重威脅人民群眾身體健康、阻礙社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大疾

2、病。目前手術(shù)根治是胃癌的主要治療方式，對(duì)于早期胃癌患者術(shù)后5年生存率較高，可達(dá)90％以上，但絕大部分胃癌在確診時(shí)已處于進(jìn)展期，喪失手術(shù)根治可能，5年生存率僅為11％-40％。西醫(yī)針對(duì)中晚期胃癌主要有根治性或姑息性手術(shù)、放化療及免疫治療等治療手段，然而全球范圍的中晚期胃癌的西醫(yī)療效并不理想，那么，中醫(yī)藥在治療中晚期胃癌的治療中就有了相當(dāng)?shù)陌l(fā)揮余地。因此，繼續(xù)尋找特異性強(qiáng)、高效低毒的抗腫瘤藥物，具有較強(qiáng)的臨床和現(xiàn)實(shí)意義。
　　近年來(lái)，

3、中醫(yī)藥在胃癌的預(yù)防及治療中發(fā)揮著較突出的作用，體外多項(xiàng)研究已證實(shí)中藥抗腫瘤效果確切。臨床實(shí)踐表明，單獨(dú)應(yīng)用中藥或中藥復(fù)方治療胃癌療效確切，同時(shí)能減輕放化療的毒副作用。黃藥子為薯截科植物黃獨(dú)(DioscoreabulbiferaL.)的塊莖，其性寒涼，味苦，具有涼血、消癭、降火、解毒的作用。黃藥子在臨床應(yīng)用廣泛，主治多種病癥。既往的文獻(xiàn)報(bào)道，中藥黃藥子具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，臨床報(bào)道運(yùn)用含有黃藥子的黃白胃癌湯、抗癌乙片等治療胃癌、賁門癌和食

4、道癌療效確切。還有報(bào)道稱黃藥子對(duì)肝癌、乳腺癌、宮頸癌、原發(fā)性支氣管肺癌、淋巴瘤等也有一定療效。相關(guān)研究表明中藥抗腫瘤機(jī)制包括:抑制原癌基因的表達(dá)，促進(jìn)抑癌基因的表達(dá);調(diào)控癌變組織周圍環(huán)境;誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡;降低胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力等。但有關(guān)黃藥子治療胃癌的具體機(jī)制尚不清楚。
　　為探討上述問(wèn)題，本研究擬通過(guò)觀察黃藥子對(duì)體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞株的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的影響，初步探討其作用的分子機(jī)制;并建立裸鼠胃癌皮下移植瘤動(dòng)

5、物模型，觀察黃藥子對(duì)荷瘤鼠的生長(zhǎng)抑制的影響。本研究對(duì)黃藥子治療胃癌提供科學(xué)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)對(duì)豐富中醫(yī)抗腫瘤理論，促進(jìn)中醫(yī)臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。
　　目的：
　　1.通過(guò)觀察黃藥子對(duì)體外胃癌細(xì)胞株SGC-7901氧化還原能力、生長(zhǎng)增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響，探討黃藥子抑制胃癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　2.通過(guò)觀察黃藥子對(duì)胃癌動(dòng)物模型腫瘤生長(zhǎng)的影響，探討黃藥子的抑瘤效果。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞，

6、黃藥子使用乙醇提取，制成不同濃度溶液。
　　2.分光光度法檢測(cè)不同濃度的黃藥子乙醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞羥基自由基和DPPH自由基清除率。
　　3.ABTS快速試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的黃藥子醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞的抗氧化能力及還原能力。
　　4.MTT法檢測(cè)不同濃度的黃藥子醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖影響。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的黃藥子醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　6.Transwell侵襲性檢測(cè)不同濃度的黃藥

7、子醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲性的影響。
　　7.建立胃癌裸鼠皮下移植瘤，觀察黃藥子醇提取物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　8.ELISA檢測(cè)胃癌裸鼠外周血中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況，觀察黃藥子醇提取物對(duì)炎性細(xì)胞因子濃度的影響。
　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)取α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.分光光度法測(cè)定結(jié)果表明:不同濃度的黃藥子乙醇提取物具有一定的

8、羥基自由基和DPPH自由基清除率。三種提取物中，濃度2mg/ml，70％乙醇提取物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，清除率為55.2％;80％乙醇提取物的·OH自由基清除能力最高，清除率為51.2％;70％和90％乙醇提取物對(duì)·OH自由基清除率分別為38.7％和39.6％。
　　2.還原能力的測(cè)試結(jié)果顯示:黃藥子醇提取物具有較強(qiáng)的還原能力。70％的乙醇提取物還原能力為每1克提取物相當(dāng)于28.1μmolFe2+，80％的乙醇提取物還原能

9、力為每1克提取物相當(dāng)于49.3μmolFe2+，90％的乙醇提取物還原能力為每1克提取物相當(dāng)于35.2μmolFe2+，其中80％的乙醇提取物具有最強(qiáng)的還原能力。
　　3.ABTS快速檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果表明:黃藥子醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力。80％乙醇提取物的清除能力最強(qiáng)，接近72％。70％和90％乙醇提取物的清除率分別為55％和45％。隨著時(shí)間的推移和濃度增大總抗氧化能力逐漸增加。最低濃度為0.2mg/ml時(shí)，其清除率為8％。最高濃

10、度為2mg/ml，清除率為52％。在4min、7min、12min，濃度為0.2、0.4、1.0mg/ml時(shí)，清除率穩(wěn)步上升。當(dāng)濃度分別為1.4、1.8、2mg/ml時(shí)，自由基清除率變化均不明顯，一般在55％和67％之間波動(dòng)。
　　4.MTT法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:不同濃度乙醇黃藥子提取物溶液均能抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖。其中，黃藥子70％乙醇提取物溶液0.5、1、2mg/ml抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖率分別為34

11、.5％、41.2％和45.6％;黃藥子80％乙醇提取物溶液0.5、1、2mg/ml抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖率分別為41.3％、55.8％和62.3％;黃藥子90％乙醇提取物溶液0.5、1、2mg/ml抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖率分別為28.7％、32.4％和34.9％;以2mg/ml的黃藥子80％乙醇提取物的抑制率最高，達(dá)62.3％。
　　5.流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示:培養(yǎng)48h后，黃藥子醇提取物可明顯促進(jìn)SG

12、C-7901細(xì)胞的凋亡，而對(duì)照組SGC-7901細(xì)胞只出現(xiàn)少量的凋亡。0.5、1和2mg/ml黃藥子70％乙醇提取物處理的SGC-7901細(xì)胞凋亡率從空白對(duì)照組的（3.8l±1.56）％分別上升至(5.36±1.85)％、(10.31±2.46)％(P＜0.05)和(18.54±3.26)％(P＜0.01);0.5、1和2mg/ml黃藥子80％乙醇提取物處理的SGC-7901細(xì)胞凋亡率分別為(6.62±1.15)％、(14.27±2.2

13、8)％(P＜0.05)和(25.07±4.21)％(P＜0.01)，并呈一定濃度依賴性。0.5、1和2mg/ml黃藥子90％乙醇提取物處理的SGC-7901細(xì)胞凋亡率分別為(5.65±1.63)％、(11.81±2.75)％(P＜0.05)和(20.32±3.54)％(P＜0.01)。
　　6.Transwell侵襲性檢測(cè)結(jié)果顯示:人胃癌SGC-7901細(xì)胞分別與0.5、1、2mg/ml80％黃藥子醇提取物溶液共培養(yǎng)24小時(shí)后，細(xì)

14、胞侵襲數(shù)目與空白對(duì)照組相比，呈降低趨勢(shì)。高倍鏡下對(duì)穿過(guò)下室面的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)照組為94.36±9.51個(gè)，0.5mg/ml黃藥子80％乙醇提取物組為67.52±7.48個(gè)，1mg/ml黃藥子80％乙醇提取物組為51.24±6.51個(gè)，2mg/ml80％黃藥子醇提取物組為38.59±5.43個(gè)，與對(duì)照組比較，0.5、1、2mg/ml80％黃藥子醇提取物可以抑制人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的侵襲(P＜0.05)，且呈劑量依賴關(guān)系。

15、>　　7.建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型情況
　　將瘤塊植入裸鼠皮下后，生長(zhǎng)至第7天，形成局部可測(cè)量瘤灶，造模成功率100％;皮下腫瘤前期生長(zhǎng)較緩，外觀呈球形或半球形，初起可活動(dòng)，日漸變硬，腫瘤大小不一，觀察期內(nèi)各組裸鼠均未出現(xiàn)明顯消瘦及體重下降。
　　8.黃藥子醇提取物對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤體積的影響
　　治療結(jié)束后，黃藥子高劑量組瘤體積小于模型組(P＜0.05)，5-FU組和黃藥子低劑量組瘤體積與模型對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

16、＞0.05)，黃藥子高劑量組與低劑量組及5-FU組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，5-FU組和黃藥子低、高劑量組三者對(duì)瘤體積的抑制率分別為25％、17.86％和39.29％。
　　9.黃藥子醇提取物對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量的影響
　　與模型對(duì)照組比較，5-FU組和黃藥子高劑量組裸鼠移植瘤質(zhì)量顯著下降(P＜0.05)，黃藥子不同劑量組之間瘤質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，高低劑量黃藥子組瘤質(zhì)量與5-FU組比較，差

17、異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，5-FU組和黃藥子低、高劑量組對(duì)荷瘤裸鼠瘤質(zhì)量的抑制率分別為37.5％、25％和43.75％。
　　10.黃藥子醇提取物對(duì)裸鼠皮下移植瘤外周血血清IL-8水平的影響
　　與模型對(duì)照組比較，5-FU組和黃藥子組裸鼠血清IL-8水平顯著下降(P＜0.05);黃藥子高劑量組血清IL-8水平明顯低于低劑量組(P＜0.05)。
　　11.黃藥子醇提取物對(duì)裸鼠皮下移植瘤外周血血清sICAM-1水平

18、的影響
　　與模型對(duì)照組比較，5-FU組和黃藥子組裸鼠血清sICAM-1水平顯著下降(P＜0.05);黃藥子高劑量組血清sICAM-1水平明顯低于低劑量組(P＜0.05);黃藥子高劑量組血清sICAM-1水平明顯低于5-FU組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.黃藥子醇提取物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞具有一定的自由基清除能力和較強(qiáng)的抗氧化還原能力;
　　2.黃藥子醇提取物能抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增