多西他賽節(jié)律化療及EGCG抑制胃癌生長(zhǎng)及抗血管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：在細(xì)胞毒性水平上最大耐受劑量(maximum tolerable dose,MTD)進(jìn)行化療是治療進(jìn)展期胃癌的主要方法,然而其毒副反應(yīng)和耐藥性嚴(yán)重影響了治療效果。為與常規(guī)化療相區(qū)別,2000年Hanahan D首次提出節(jié)律性化療的概念,也就是持續(xù)低劑量化療(continuous low-dose chemotherapy,LDM),這種小劑量、高頻率化療的方法,增加了對(duì)腫瘤微血管的靶向治療效果,毒副反應(yīng)小,且不易產(chǎn)生耐藥。多西他賽

2、為紫杉類抗腫瘤藥物,有實(shí)驗(yàn)報(bào)道其具有顯著的抗血管生成作用,以多西他賽為基礎(chǔ)的化療方案是近20年來胃癌治療的重要進(jìn)展之一。
　　 節(jié)律化療與其它抗血管生成藥物合用時(shí)抗腫瘤效果明顯提高,但目前所發(fā)現(xiàn)的血管抑制劑多為基因重組表達(dá)的蛋白制劑,面臨著用藥劑量大、提取困難、微生物的浸入、價(jià)格昂貴及患者需長(zhǎng)期堅(jiān)持服用等方面的困擾,在臨床應(yīng)用中受到一定的制約。最新研究顯示綠茶及其最主要的活性成分表沒食子幾茶素沒食子酸酯[(-)-epigallo

3、catechin-3-gallate,EGCG]具有抗血管生成作用。因此,本實(shí)驗(yàn)擬探討節(jié)律多西他賽和血管形成抑制劑EGCG對(duì)胃癌生長(zhǎng)及腫瘤血管生成的抑制作用,并探討二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌的治療價(jià)值。
　　 材料與方法：
　　 1、采用低劑量的多西他賽,持續(xù)作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilicalvein endothelial cells,HUVEC)和人BGC-823胃癌細(xì)胞株144 h,MTT法觀察細(xì)胞增

4、殖、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定刪VEC及BGC-823細(xì)胞血小板反應(yīng)素1(thrombostondin-1,TSP-1)Mrna的表達(dá)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各條件培養(yǎng)液中TSP-1的蛋白分泌。
　　 2、MTT法測(cè)定EGCG對(duì)BGC-823細(xì)胞及HUVEC細(xì)胞增殖的影響取人胃癌細(xì)胞株BGC823細(xì)胞及HUVEC細(xì)胞,分別加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的EGCG,使其終濃度分別為5

5、,10,20,40,80μmol/L,對(duì)照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液。48 h、96 h和144 h后,MTT法檢測(cè)各孔吸光度值(OD值),計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。
　　 3、MTT法測(cè)定多西他賽與EGCG聯(lián)合用藥對(duì)BGC-823細(xì)胞及HUVEC細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的協(xié)同性觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞及HUVEC細(xì)胞分別加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中過夜培養(yǎng),次日分別加入多西他賽(終濃度分別為0.001,0.01,0.1,1 nmol

6、/L),EGCG20μmol/L,EGCG20μmol/L與多西他賽(終濃度為0.001,0.01,0.1,1 nmol/L)混合液,144 h后MTT法檢測(cè)各孔吸光度值(OD值),計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。計(jì)算Q值,并判斷兩藥的聯(lián)合效應(yīng)。
　　 4、建立荷人BGC-823胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,將荷瘤小鼠隨機(jī)分成5組,對(duì)照組、MTD組、LDM組、EGCG組及聯(lián)合組,分別給予0.9％氯化鈉溶液、最大耐受劑量多西他賽、低劑量多西他賽、E

7、GCG及低劑量多西他賽聯(lián)合EGCG腹腔注射,觀察腫瘤生長(zhǎng)情況,小鼠體重和外周血白細(xì)胞數(shù)。免疫組化染色,測(cè)定CD31和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)情況。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果數(shù)據(jù)以x-±s表示,采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用單因素方差分析和Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1、多西他賽對(duì)人H

8、UVEC的抑制作用強(qiáng)于對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞的抑制作用,計(jì)算的IC50值分別為0.06±0.005 nmol/L和1.1±0.024 nmol/L。較低IC50濃度的多西他賽作用于HUVEC引起細(xì)胞凋亡的百分比近似于較高IC50濃度的多西他賽作用于BGC-823細(xì)胞的百分比。多西他賽明顯地增加了人HUVEC的TSP-1表達(dá)(為對(duì)照組的1.78±0.18倍),而且明顯地增加了TSP-1蛋白的分泌,與對(duì)照組的100％相比,多西他賽組為80

9、6±73％(P＜0.05),而腫瘤細(xì)胞的TSP-1表達(dá)和分泌沒有增加。
　　 2、EGCG對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用,呈時(shí)間、劑量依賴性,隨著濃度的增加,時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制作用增強(qiáng)(P＜0.05)。同一時(shí)間,BGC-823細(xì)胞增殖抑制率與EGCG濃度呈正相關(guān);同一濃度,BGC-823細(xì)胞增殖抑制率與作用時(shí)間呈正相關(guān)。
　　 較小劑量(5μmol/L和10μmol/L)EGCG作用于HUVEC細(xì)胞時(shí),無明

10、顯抑制作用;20μmol/L EGCG在48 h治療后明顯抑制了HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng);然而當(dāng)劑量大于20μmol/L(40μmol/L和80μmol/L)時(shí)完全阻止了HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 3、EGCG與各種濃度的多西他賽聯(lián)用均可明顯抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),二者有明顯的協(xié)同作用,Q值均大于1.15。EGCG與各種濃度的多西他賽聯(lián)用均可明顯抑制HUVEC細(xì)胞增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

11、P＜0.05),EGCG與較低濃度(0.001,0.01,0.1 nmol/L)的多西他賽聯(lián)用有明顯的協(xié)同作用,Q值均大于1.15,EGCG與較高濃度(1 nmol/L)的多西他賽聯(lián)用,Q值為1.07,二者具有相加作用。
　　 4、對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)迅速,其他治療組腫瘤生長(zhǎng)都受到了抑制,其中聯(lián)合治療組抑瘤效果最顯著,與單藥組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LDM組、EGCG組及聯(lián)合組與對(duì)照組相比,無明顯的毒副作用,而MTD組小

12、鼠體重和白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下降。對(duì)照組腫瘤組織的MVD及VEGF的表達(dá)水平最高,與對(duì)照組比較,各治療組腫瘤組織微血管密度(microvessel density,MVD)及VEGF的表達(dá)均下降,差異有顯著性(P＜0.05);與MTD組比較,LDM組和EGCG組腫瘤組織MVD表達(dá)也下降(P＜0.05);與單藥組比較,聯(lián)合組MVD及VEGF表達(dá)下降更多(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、多西他賽節(jié)律化療優(yōu)先抑制了內(nèi)皮細(xì)胞

13、的增殖和誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,其機(jī)制可能是由于多西他賽節(jié)律化療增加了內(nèi)皮細(xì)胞TSP-1的表達(dá)和分泌；
　　 2、EGCG能夠抑制胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖,呈時(shí)間、劑量依賴性,與多西他賽聯(lián)合有協(xié)同作用。EGCG與多西他賽聯(lián)合對(duì)HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制有協(xié)同或相加作用；
　　 3、多西他賽節(jié)律化療能夠有效抑制裸鼠胃癌移植瘤的生長(zhǎng)及微血管的形成,與MTD組相比,抑瘤效果顯著且持久,而且無明顯的毒副作用,與EGCG聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效