RNA同時(shí)干擾四個(gè)不同基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞CNE-2Z生長(zhǎng)增殖的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鼻咽癌是我國(guó)華南地區(qū)一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，且發(fā)病率高。目前鼻咽癌的治療多采用放療為主結(jié)合化療免疫治療及手術(shù)治療、中醫(yī)治療等的綜合療法。但由于放療后易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，以及鼻咽癌細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感和化療藥物的嚴(yán)重毒副作用，從而影響了預(yù)后，并限制了進(jìn)一步提高患者生存率。因此，從基因治療的角度，尋找毒性低、療效好、特異性強(qiáng)的新的治療技術(shù)具有重要的臨床意義。
　　 RNA干擾技術(shù)是當(dāng)今研究鼻咽癌基因治療領(lǐng)域的。一個(gè)熱點(diǎn)。它是一種轉(zhuǎn)

2、錄后基因沉默現(xiàn)象，在以往的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)單基因RNA干擾能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。然而無(wú)論在基礎(chǔ)研究或臨床實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)干擾某個(gè)基因?qū)ρ芯磕[瘤的防治方面存在有很大局限性。利用分子生物學(xué)技術(shù)，針對(duì)不同基因發(fā)展的基因治療技術(shù)，通過(guò)改變或修飾相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的方式治療惡性腫瘤已成為腫瘤生物治療中最引人注目的研究領(lǐng)域，也可能是惡性腫瘤治療的希望所在。目前國(guó)內(nèi)外研究同時(shí)干擾多個(gè)基因的報(bào)道較少。尤其三個(gè)以上的基因同時(shí)干擾更為少見(jiàn)。聯(lián)合沉默腫瘤細(xì)胞

3、中多個(gè)癌基因，會(huì)成為研究腫瘤基因治療的一個(gè)前沿問(wèn)題。也是腫瘤基因治療中一個(gè)新的研究方向。
　　 由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因突變多步驟多因素共同作用的結(jié)果，我們分析，如果同時(shí)阻斷其中的幾條通路，對(duì)腫瘤的治療效果可能比只阻斷一條要好，為進(jìn)一步研究多基因共沉默在腫瘤治療中的作用，我們帶著這樣一個(gè)全新觀念需要驗(yàn)證的思路，通過(guò)不同檢驗(yàn)手段付諸于實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證多個(gè)基因串聯(lián)在一起的真核質(zhì)粒能否同時(shí)沉默目的基因的表達(dá)并且能否能夠最大限度地發(fā)揮基因沉

4、默的效果。研究多基因共干擾的前提是設(shè)計(jì)出一種方法，能夠同時(shí)轉(zhuǎn)染干預(yù)多個(gè)基因的表達(dá)。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用分子生物學(xué)基因克隆技術(shù)，VEGF，C—myc，Survivin，hTERT的cDNA序列構(gòu)建并鑒定一個(gè)載體同時(shí)編碼VEGF，C—myc，Survivin，hTERT四個(gè)不同基因的shRNA質(zhì)粒，與干擾單基因進(jìn)行比較，將其導(dǎo)入CNE—2Z細(xì)胞，研究其能否對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的抑制作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，能否最大限度地提高單個(gè)基因的沉

5、默效率，為研究鼻咽癌基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)并提供治療策略，有望為鼻咽癌基因治療提供一個(gè)行之有效的新思路。
　　 方法：
　　 (1)構(gòu)建同時(shí)表達(dá)VEGF，C—myc，Survivin，hTERT并含熒光素標(biāo)記的shRNA質(zhì)粒命名為P—1，并構(gòu)建單獨(dú)表達(dá)VEGF，C—myc，Survivin，hTERT的質(zhì)粒，分別命名為P—2，P—3，P—4，P—5，分別將其將轉(zhuǎn)染人鼻咽癌CNE—2Z細(xì)胞株。
　　 (2)以激光共聚

6、焦顯微鏡觀察質(zhì)粒在CNE—2Z細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)情況。
　　 (3)以噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。
　　 (4)real—time—PCR在mRNA水平上檢測(cè)對(duì)目的基因表達(dá)的抑制作用。
　　 (5)免疫印跡法在蛋白水平上檢測(cè)對(duì)目的基因的封閉效果。
　　 (6)Transwell侵襲小室模型觀察導(dǎo)入CNE—2Z細(xì)胞對(duì)其惡性生物學(xué)行為的改變。
　　 (7)流式細(xì)胞儀觀察各組凋亡率。
　　 (8)體內(nèi)

7、裸鼠成瘤：以激光共聚焦顯微鏡觀察質(zhì)粒在移植瘤癌組織中轉(zhuǎn)染及表達(dá)情況并通過(guò)體積變化，RT—PCR和免疫印跡及TUNNEL凋亡檢測(cè)等指標(biāo)觀察質(zhì)粒對(duì)腫瘤的抑制效果。
　　 結(jié)果：
　　 (1)載體構(gòu)建與鑒定質(zhì)粒載體pGenesil1．1，pGenesil1．2，pGenesil1．3，pGenesil1．4里面來(lái)只有一個(gè)SacI的酶切位點(diǎn)，而質(zhì)粒VEGF，C—cmy，Survivin，hTERT均能夠被SacI所酶切出一條約9

8、00bp，600bp，900bp，600bp不等的DNA條帶，說(shuō)明目的基因片段VEGF，C—myc，Survivin，hTERT已經(jīng)分別插入到質(zhì)粒載體pGonesil1．1，pGcnesil1．2，pGenesil1．3，pGonesil1．4里。挑取克隆正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液VEGF，C—myc，Survivin，hTERT去測(cè)序。經(jīng)測(cè)序結(jié)果分析：均為插入正確的克隆質(zhì)粒，而且質(zhì)量均符合設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用有效的克隆技術(shù)，構(gòu)建出一個(gè)載

9、體同時(shí)編碼4個(gè)不同基因的表達(dá)質(zhì)粒，這將為以后多基因共沉默奠定堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。
　　 (2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h，空白對(duì)照組未見(jiàn)表達(dá)的綠色熒光細(xì)胞。其他各組均可見(jiàn)大量表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞，其中陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，有許多貼壁細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。多基因組和各單基因組出現(xiàn)大量懸浮的表達(dá)綠色熒光的圓形死亡細(xì)胞。其中多基因組凋亡細(xì)胞數(shù)較多。我們將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE—2Z細(xì)胞后共聚焦顯微鏡下觀察到大量表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞，說(shuō)明質(zhì)粒能有效轉(zhuǎn)

10、染該細(xì)胞。
　　 (3)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力與空白對(duì)照組比較，P—1、P—2、P—3、P—4、P—5各組各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞吸光度A值均顯著下降，P<0．05；p—1組分別和P—2、P—3、P—4、P—5各組之間比較，p—1組各時(shí)間點(diǎn)的吸光度A值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0．05。BC和NC組各時(shí)間點(diǎn)的吸光度A值差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0．05。p—1和P—2、P—3、P—4、P—5轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞96小時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別達(dá)到72％、42％、41

11、％、40％、45％。MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，多基因組細(xì)胞增殖明顯受抑制，說(shuō)明同時(shí)沉默VEGF，C—myc，Survivin，hTERT四個(gè)基因比單獨(dú)沉默其中的一個(gè)基因能更有效的抑制CNE—2Z細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 (4)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)不同基因在不同組別中的mRNA定量表達(dá)．在p—1和p—2中VEGF的抑制率分別是：76．47％±2．08和69．75％±3．05在p—1和p—3中C—myc的抑制率分別是：79．73％±3．01和7

12、7．43％±1．98在p—1和p—4中Survivin的抑制率分別是：80．89％±2．35和73．92％±2．56在p—1和p—5中hTERT的抑制率分別是：74．60％±2．68和70．47％±2．87。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示各個(gè)單基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE—2Z細(xì)胞后引起單個(gè)基因的mRNA表達(dá)下降，多基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE—2Z細(xì)胞后引起四個(gè)基因的mRNA同時(shí)表達(dá)下降，說(shuō)明多基因組的mRNA沉默作用強(qiáng)于單基因。
　　 (5)轉(zhuǎn)染48小

13、時(shí)后western blotting蛋白檢測(cè)。VEGF基因在P—1、P—2中的蛋白抑制率分別是66．95％±2．42和64．30％±3．13，C—myc基因在P—1、P—3中的蛋白抑制率分別是62．89％±2．97和59．18％±3．09 Survivin基因在P—1、P—4中的蛋白抑制率分別是79．48％±1．92和70．51％±2．56hTERT基因在P—1、P—5中的蛋白抑制率分別是79．60％4±1．87和76．33％±4．11

14、。蛋白印記結(jié)果顯示各個(gè)單基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE—2Z細(xì)胞后引起單個(gè)基因的蛋白表達(dá)下降，多基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE—2Z細(xì)胞后引起四個(gè)基因的蛋白同時(shí)表達(dá)下降，說(shuō)明多基因組的蛋白沉默作用強(qiáng)于單基因。
　　 (6)Trans well侵襲小室模型測(cè)定細(xì)胞體外侵襲能力。7組細(xì)胞在48h后Transwell侵襲小室中多基因組穿膜細(xì)胞數(shù)比空白對(duì)照組和單基因組明顯減少(P<0．05)單基因組和空白對(duì)照組穿襲細(xì)胞數(shù)也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0．05)，而陰性

15、對(duì)照組與空白對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0．05)，表明單基因質(zhì)粒和多基因組質(zhì)粒均可轉(zhuǎn)染可降低CNE—2Z細(xì)胞的體外侵襲能力，其中多基因組比單基因組更能明顯地降低鼻咽癌細(xì)胞穿襲能力。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，體外侵襲能力明顯降低，說(shuō)明同時(shí)沉默VEGF，C—myc，Survivin，hTERT四個(gè)基因比單獨(dú)沉默其中的一個(gè)基因能更有效地降低惡性侵襲力。
　　 (7)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。處理48小時(shí)后，空白對(duì)照組凋亡率是5．3％

16、±1．26，陰性對(duì)照組凋亡率是7．4％±1．02，p—1組凋亡率是37．6％±0．94，p—2組凋亡率是20．6％±1．27，p—3組凋亡率是22．6％±0．98，p—4組凋亡率是23．7％±1．09，p—5組凋亡率是22．9％±1．31，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組凋亡率比較二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0．05)。單基因組與空白對(duì)照組凋亡率比較二者之間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0．05)。多基因組與空白對(duì)照組凋亡率比較二者之間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

17、p<0．01)。單基因和多基因組凋亡率比較二者之間具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0．05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明同時(shí)沉默腫瘤細(xì)胞中多個(gè)基因比單獨(dú)沉默一個(gè)基因能夠更好的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 (8)癌裸鼠動(dòng)物模型的治療效果。空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組裸鼠腫瘤持續(xù)增長(zhǎng)，體積明顯增大；多基因治療組和單基因治療組腫瘤生長(zhǎng)緩慢，其中多基因治療腫瘤生長(zhǎng)速度最慢．熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒治療組和陰性對(duì)照組可見(jiàn)大片癌組織表達(dá)綠色熒光，而空白對(duì)照組

18、的移植瘤未見(jiàn)綠色熒光。在治療結(jié)束時(shí)，P—1，P—2、P—3、P—4、P—5組腫瘤比空白對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制。各組抑瘤率分別是，P—1：82．40％、P—2：46．24％、P—3：48．47％、P—4：51．93％、P—5：46．78％．TUNEL法檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡率：空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組偶可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)為分別為2．8±01．12、3．7±0．95；VEGF、C—myc、Survivin和hTERT單基因質(zhì)粒組凋亡細(xì)胞凋

19、亡指數(shù)分別為21．5％±2．31、23．8％±1．98、19．9％±2．75和24．60％±3．09。多基因質(zhì)粒組凋亡細(xì)胞明顯增多凋亡指數(shù)為49．8％±1．98。表明單基因組和多基因組對(duì)鼻咽癌移植瘤均有誘導(dǎo)凋亡作用，其中多基因組誘導(dǎo)凋亡作用最明顯。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)多基因干擾證實(shí)了不同基因的沉默導(dǎo)致相應(yīng)mRNA及目的蛋白的表達(dá)下調(diào)，從而有效抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，移植瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，初步證實(shí)