短乳桿菌精氨酸脫亞胺酶的重組表達及其性質(zhì)研究.pdf

1、精氨酸脫亞胺酶（Arginine deiminase，EC3.5.3.6），簡稱ADI，作為一種精氨酸降解酶，被認(rèn)為是極具潛力的新型抗癌藥，其針對原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)、黑素瘤等精氨酸缺陷型腫瘤具有明顯的治療作用。此外，研究表明，ADI對于急性淋巴細(xì)胞白血病的療效要明顯優(yōu)于L-天冬酰胺酶。然而，目前所有應(yīng)用于臨床研究的ADI都來源于支原體（Mycoplasma arginini），將其作為一種作用于人體的藥物來源，存在一定的安全隱患;

2、且已報道的ADI在人體生理條件下普遍存在酶活力低、底物親和性弱、半衰期短等局限性。因此，尋找更加安全、高效的ADI具有重要意義。
　　本研究以一株精氨酸雙水解酶陽性的益生性乳酸菌—短乳桿菌（Lactobacillus brevis CGMCC1306）為材料，在分析該菌株精氨酸代謝特征、解析精氨酸水解基因簇基礎(chǔ)上，首次克隆了其ADI編碼基因，實現(xiàn)了原核異源表達，并對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究，為進一步探索其應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。

3、r>　　主要結(jié)果如下:
　　精氨酸水解產(chǎn)物譜分析顯示，L.brevis CGMCC1306具有完整的精氨酸水解系統(tǒng)，在弱酸性條件下，該菌可以通過ADI、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)及氨基甲酸激酶(CK)依次將精氨酸降解為瓜氨酸、鳥氨酸和磷酸氨甲酰，同時產(chǎn)生ATP、CO2和NH3。精氨酸水解相關(guān)基因克隆分析顯示，這些相關(guān)基因在菌株基因組上聚集成簇，且其組成結(jié)構(gòu)為:arcABDTCR，這與目前已報道其它微生物的精氨酸水解基因簇結(jié)構(gòu)及

4、組成差異明顯。
　　采用PCR擴增獲取該菌株編碼ADI的arcA基因，序列分析結(jié)果表明該片段開放讀碼框為1233 bp，編碼410個氨基酸，其蛋白計算分子量為45.9 kDa。Blast分析顯示，該基因序列與L.brevis KB290的arcA序列僅存在一個差異堿基，且兩者的氨基酸序列相一致;與米曲霉乳桿菌（Lactobacillus oryzae JCM18671）和布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri N

5、RRL B-30929）蛋白相似性分別高達91％與82％;而相比于已報到的其它非乳酸菌，如銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）和M.arginini，盡管其蛋白序列相似性均僅有34％，但它們都具有相同的保守結(jié)構(gòu)域（FTRD，EGGD，MHLDT和CMSxP）和催化中心(C-H-G)。
　　將獲得的arcA片段克隆至pMD18-T載體，測序驗證后進一步亞克隆至表達載體pET-28a(+)中并構(gòu)建重組表達工程菌E

6、.coli BL21(DE3)/pET-28a-ADI。對重組菌株進行IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析表明重組ADI獲得了表達。然而，該重組ADI對咪唑高度敏感，具有催化活性的粗酶液經(jīng)Ni-NTA親和層析后，失去催化能力，且充分透析后，其催化活力仍不能恢復(fù)。于是本研究進一步構(gòu)建了表達非冗余ADI的重組載體pET-21a-ADI及工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET-21a-ADI，將其粗酶液通過HiPrep DEAE FF

7、離子交換層析和SeperdexTM G-200凝膠過濾進行分離純化后得到電泳純的重組ADI，每升誘導(dǎo)培養(yǎng)物可獲得2.8 mg重組蛋白，其比活力為71.5 U/mg，純化倍數(shù)為55倍，回收率為47.7％。凝膠過濾液相色譜測得重組ADI的蛋白分子量大小為183 kDa，而SDS-PAGE凝膠電泳顯示其單體大小約為46 kDa，因此推斷該重組酶為同源四聚體。對重組ADI的酶學(xué)特性進行研究，結(jié)果表明，其最適反應(yīng)溫度為60℃、最適pH為6.0，其