肽基精氨酸脫亞胺酶4(PADI14)基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌、食管癌、乳腺癌易感性的相關性研究.pdf

1、近年來關于腫瘤遺傳易感性的研究倍受關注。腫瘤的發(fā)生過程多是由易感基因與環(huán)境等岡素相互作用所決定的。易感基因在腫瘤的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。肽基精氨酸脫亞胺酶4(PADI4)作為一種翻譯后修飾酶能將底物蛋白的精氨酸殘基催化生成瓜氨酸。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)PADI4在結(jié)直腸癌、食管癌、乳腺癌等絕大多數(shù)惡性腫瘤及患者血液中有特異高表達,并通過修飾抗凝血酶、細胞角質(zhì)蛋白和細胞纖維連接蛋白刺激腫瘤毛細血管增生和抑制細胞凋亡。該結(jié)果已被國外兩所

2、實驗室證實,SCI論文他引30次。最近有人發(fā)現(xiàn)PADI4可與P53組成分子開關調(diào)控抑癌基因的表達。可見,PADI4在腫瘤癌變過程中起著非常重要的作用,有可能是腫瘤易感基因。國外已有實驗室將皮膚基底癌易感基因定位于1p36,而PADI4恰好位于該區(qū)域。但目前國內(nèi)外均沒有對PADI4基因組單核苷酸多態(tài)性(SNP)與腫瘤之間的相關性進行研究。PADI4基因組DNA上是否會有SNP通過影響蛋白的表達量、結(jié)構或者功能而參與腫瘤病變過程也無人知曉。

3、我們首先用基因芯片對PADI4基因上的74個tagSNP進行了篩選,發(fā)現(xiàn)有多個位點與結(jié)直腸癌、食管癌、乳腺癌等惡性腫瘤呈強相關性。為驗證芯片結(jié)果,本研究采用大樣本,用TaqMan-PCR的方法對篩選到的腫瘤相關的tagSNP包括rS1886302、rs2477131、rs1635561和rs1635567位點進行基因分型,分析上述位點是否與結(jié)直腸癌、食管癌、乳腺癌易感性相關。
　　 目的：在實驗室前期工作基礎上,從基因組水平深入

4、研究PADI4的基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌、食管癌、乳腺癌易感性的關系,分析PADI4的SNP位點等位基因/基因型與結(jié)直腸癌、食管癌、乳腺癌之間的關聯(lián)性,證明PADI4是三種惡性腫瘤的易感基因。
　　 方法：本研究采用“病例-對照”的方法,實驗對象包括515例結(jié)直腸癌患者(女性179例,平均年齡55.93±12.04)、707例食管癌患者(女性224例,平均年齡52.29±11.79)和的191例乳腺癌患者(全部女性,平均年齡47.8

5、0±10.43),以及549例健康人群(女性192例,平均年齡46.44±12.96)作為結(jié)直腸癌和食管癌的對照,329例女性(平均年齡44.89±13.47)作為乳腺癌的對照。本實驗按如下步驟進行：⑴根據(jù)國際人類基因組單倍體型圖計劃(http://www.hapmap.org/)公布的SNP數(shù)據(jù),優(yōu)先選取最小等位基因頻率大于0.05,位于外顯子區(qū)域、3'和5'調(diào)控區(qū)以及外顯子內(nèi)含子交界處上(下)游1000bp內(nèi)的tagSNP作為遺傳標

6、記定制基因芯片。⑵應用Omega E-Z96血液基因組DNA提取試劑盒(E-Z96 Blood DNA Kit)提取腫瘤患者和健康對照血液全基因組DNA;⑶選取每種腫瘤120例/正常對照150例利用基因芯片進行基因分型和統(tǒng)計分析。根據(jù)芯片結(jié)果篩選出4個tagSNP位點包rs1886302、rs2477131、rS1635561和rs1635567。然后對四個位點在515例結(jié)直腸癌、707例食管癌以及549例健康對照中采用TaqMan-P

7、CR方法進行了驗證,對rs2477131和rs1635561位點在191例乳腺癌和329例女性對照中采用同樣方法進行了驗證。⑷擬合優(yōu)度x2檢驗(Goodness-of-fit Chi-square test)分析病例、對照組基因型頻率的分布是否符合H-W平衡;⑸分別基于基因型和等位基因頻率的“病例-對照”關聯(lián)分析,其中基因型分析在3種遺傳模式下應用SPSS11.5軟件進行非條件Logistic回歸模型分析評估單個點基因型與惡性腫瘤發(fā)生風

8、險的相關程度,并計算優(yōu)勢比(OR)及95％可信區(qū)間(CIs);⑹連鎖不平衡和單倍體型分析:應用Haploview4.0軟件計算以上位點組成的單倍體型,并用SHEsis軟件分析每種單倍體型在病例組和對照組之間的分布差異;⑺SNP位點基岡型與性別關聯(lián)分析:用SPSS11.5軟件分別計算結(jié)直腸癌組、食管癌組不同性別之間的基岡型分布差異。
　　 結(jié)果：①流行病學資料分析:結(jié)直腸癌、食管癌、乳腺癌組和相應的對照組之間年齡、性別分布無統(tǒng)計學

9、差異(P>0.05)。②病例組和對照組H-W平衡檢驗:結(jié)直腸癌組、食管癌組以及對照組中rs1635567位點基因型分布不符合H-W平衡(P<0.05),故在后續(xù)的結(jié)果分析中舍棄這個位點。另外的3個位點基因型在病例組以及它們各自的對照組中均符合H-W平衡(P>0.05)。③SNP位點等位基因多態(tài)性分析結(jié)果:結(jié)直腸癌組與對照組分析發(fā)現(xiàn)rs1886302位點等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義,(P=0.036)。而食管癌組與對照組中rs1886

10、302、rs1635561和rs2477131位點等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。乳腺癌與對照組的rs163556l和rs2477131個位點等位基因頻率分布差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。④SNP位點基因型多態(tài)性分析結(jié)果:結(jié)直腸癌與對照組比較rs1886302位點顯性遺傳模式差異有顯著意義(P=0.040)。食管癌組與對照組比較,rs1886302、rs1635561和rs2477131位點的3種遺傳模式差異均無

11、統(tǒng)計學意義(P>0.05)。乳腺癌組與對照組比較,rs1635561和rs2477131位點也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。⑤PADI4基因單體型分析結(jié)果:連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)rs1886302與rs2477131位點緊密連鎖,可組成3種單體型,AA、GA、GG,但是統(tǒng)計分析并沒有發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌、食管癌易感性相關的陽性單體型(P>0.05)。⑥性別關聯(lián)分析結(jié)果:結(jié)直腸癌組中rs1886302位點男性和女性基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0

12、.05),食管癌組rs1635561和rs2477131位點男性和女性基因型分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)rs1635561和rs2477131位點與結(jié)直腸癌、食管癌、乳腺癌易感性不相關,rs1886302位點與結(jié)直腸癌易感性相關,進一步分析可知A等位基因或AA基因型對結(jié)直腸癌發(fā)病有保護作用,且該位點的基因型頻率分布在結(jié)直腸癌病例組中有性別差異。由此可以說明PADI4基因遺傳變異是影響結(jié)直腸癌易