酵母轉(zhuǎn)醛醇酶2晶體結(jié)構(gòu)與功能研究及鉤端螺旋體DDG醛縮酶初步晶體學(xué)研究.pdf

1、醛縮酶是一類裂解酶，狹義的醛縮酶指的是1，6-二磷酸-D-果糖醛縮酶(EC4.1.2.13)，它可以催化裂解1，6-二磷酸-D-果糖，生成3-磷酸-D-甘油醛和α-二羥丙酮磷酸這樣一個(gè)可逆的醛醇縮合裂解反應(yīng)。而廣義的醛縮酶包括很多催化同類型反應(yīng)的酶，本論文中研究的轉(zhuǎn)醛醇酶(轉(zhuǎn)二羥丙酮基酶)(EC2.2.1.2)和2-脫氫-3-脫氧葡糖二酸醛縮酶(EC4.1.2.20)都屬于醛縮酶家族。醛縮酶參與糖酵解過程，可以高效地催化酮對受體醛的立體

2、選擇性加成，即催化代謝物質(zhì)C-C鍵的形成與斷裂，而C-C鍵的立體選擇性形成是有機(jī)合成化學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要反應(yīng)。所以，醛縮酶作為一種很有前景的生物合成劑被廣為研究和應(yīng)用。 根據(jù)催化性質(zhì)的差異，可以把醛縮酶分為兩個(gè)類型：Ⅰ型醛縮酶和Ⅱ型醛縮酶。前者主要存在于高等植物以及動(dòng)物中，該型醛縮酶酶活能力的發(fā)揮需要在酶的核心結(jié)構(gòu)的一個(gè)賴氨酸(Lysine)殘基形成Schiff堿中間體；后者主要存在于細(xì)菌和真菌中，在其催化過程中，需要二價(jià)金屬陽離

3、子在其活性部位作為輔因子發(fā)揮作用。 轉(zhuǎn)醛醇酶屬于Ⅰ型醛縮酶，在糖代謝戊糖磷酸途徑的非氧化階段能夠可逆的催化景天庚酮糖-7-磷酸的二羥丙酮部分轉(zhuǎn)移給甘油醛-3-磷酸，生成果糖-6-磷酸和赤蘚糖-4-磷酸。酵母基因組的一個(gè)開放閱讀框NQM1/YGR043C編碼的一段氨基酸序列運(yùn)用COG數(shù)據(jù)庫分析認(rèn)為是一個(gè)轉(zhuǎn)醛醇酶，但是關(guān)于這個(gè)基因目前為止還沒有任何直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本課題的目的就是希望了解它并證明它是否是一個(gè)轉(zhuǎn)醛醇酶。 2-脫

4、氫-3-脫氧葡糖二酸醛縮酶屬于Ⅱ型醛縮酶，能夠可逆的催化2-脫氫-3-脫氧葡糖二酸分裂成丙醇二酸半醛和丙酮酸。作為丙酮酸代謝途徑中非常重要的酶，鉤端螺旋體2-脫氫-3-脫氧葡糖二酸醛縮酶被當(dāng)成抗鉤端螺旋體病的生物制劑的一種靶蛋白而備受重視。 (一)關(guān)于NQM1/YGR043C的課題，我們從酵母基因組中克隆出了該基因，并成功構(gòu)建其pET22b(+)和pET28a載體的表達(dá)質(zhì)粒；表達(dá)并純化了此重組蛋白；利用轉(zhuǎn)醛醇酶酶活實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其確

5、實(shí)存在轉(zhuǎn)醛醇酶活性；利用懸滴氣相擴(kuò)散法篩選出了NQM1/YGR043C晶體的初步生長條件，通過優(yōu)化最終獲得了適于X-ray衍射的晶體；在北京同步輻射收集了一套1.9A的常規(guī)數(shù)據(jù)，空間群為I212121，晶胞參數(shù)為a=85.03A，b=113.46A，c=158.92A，α=β=γ=90°；利用分子置換方法解析出了NQM1/YGR043C晶體的衍射相位，并通過模型構(gòu)建和精修獲得了1.9A分辨率的最終結(jié)構(gòu)模型。 NQM1/YGR04

6、3C核心結(jié)構(gòu)是一個(gè)非常保守的(α/β)8桶，8個(gè)扭曲的平行的βstrand(β1-8strand)排列在一起組成一個(gè)很像啤酒桶的結(jié)構(gòu)內(nèi)核，連接這些彼此平行的βstrand的7個(gè)α螺旋(α2-8螺旋，缺失α1螺旋)纏繞在桶的外沿，另外，在核心的(α/β)8桶外周還圍繞著7個(gè)α螺旋(αA-G螺旋)。 分析NQM1/YGR043C與同源轉(zhuǎn)醛醇酶的氨基酸序列和二級結(jié)構(gòu)分布，所有轉(zhuǎn)醛醇酶亞家族的特征性高度保守的殘基都能在NQM1/YGR0

7、43C中發(fā)現(xiàn)。比較NQM1/YGR043C與同源轉(zhuǎn)醛醇酶(人源轉(zhuǎn)醛醇酶和大腸桿菌轉(zhuǎn)醛醇酶B)的三維結(jié)構(gòu)，證實(shí)其和同源物之間不僅具有非常相似的整體結(jié)構(gòu)和核心的(α/β)8桶結(jié)構(gòu)。而且所有關(guān)鍵的活性相關(guān)的氨基酸殘基，位置和構(gòu)象都保持了高度的一致。另外在TAL2_YEAST(NQM1/YGR043C)晶體結(jié)構(gòu)的表面發(fā)現(xiàn)了文獻(xiàn)報(bào)道中提到的轉(zhuǎn)醛醇酶的可能的底物傳遞通道，這一通道從Ser173殘基直至Lvs144殘基，主要由β4、β5strand及

8、緊隨β5strand的一段loop上的若干氨基酸殘基組成。 綜上實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)和證據(jù)，證實(shí)NQM1/YGR043C編碼的確實(shí)是一個(gè)轉(zhuǎn)醛醇酶，TAL2_YEAST，另外還推斷了TAL2_YEAST與其同源酶相似的催化過程。 (二)關(guān)于鉤端螺旋體2-脫氫-3-脫氧葡糖二酸醛縮酶，我們從含有目的基因的質(zhì)粒中克隆出了編碼鉤端螺旋體DDG醛縮酶的基因，并成功構(gòu)建其pET22b(+)載體的表達(dá)質(zhì)粒；表達(dá)并純化了鉤端螺旋體DDG醛縮酶蛋白；

9、利用懸滴氣相擴(kuò)散法篩選出了鉤端螺旋體DDG醛縮酶晶體的初步生長條件，并通過優(yōu)化獲得了分辨率高于3A的晶體；利用金屬離子和甘油濃度梯度篩選出合適的冷凍保護(hù)策略，提高了鉤端螺旋體DDG醛縮酶晶體耐受X-Ray的能力，足以收取完整的數(shù)據(jù)；在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)光源收集了一套2.2A的常規(guī)數(shù)據(jù)，晶體空間群類型屬于C2,晶胞參數(shù)為a=293.5A，b=125.6A，c=87.6A，α=γ=90°，β=100.9°，并利用分子置換方法得到了一個(gè)初步的相位。