膽堿對(duì)缺血性腦血管新生的影響及其藥理學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與給藥方法
　　背景：
　　腦卒中具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點(diǎn)。缺血性腦卒中占腦卒中絕大多數(shù)，所占比例約87％。腦卒中是全球60歲以上人口第二位死亡原因和15～59歲人口第五位死亡原因，在我國(guó)腦卒中已經(jīng)成為城市第三位和農(nóng)村人口第二位死亡原因。目前我國(guó)腦卒中患者約750萬(wàn)，其中450萬(wàn)致殘，喪失勞動(dòng)能力或基本生活自理能力；每年新發(fā)病例250萬(wàn)，我國(guó)缺血性腦卒中發(fā)病率仍以每年8.7%的速率上升。腦卒中嚴(yán)

2、重危害人類(lèi)健康，造成患者及其家庭和國(guó)家嚴(yán)重的醫(yī)療、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，我國(guó)每年腦卒中造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)400億元，是其他心血管疾病的10倍。
　　缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，與能量耗竭、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸的毒性作用、一氧化氮（NO）、鈣超載、細(xì)胞凋亡、炎癥等密切相關(guān)。缺血性腦卒中臨床治療方法是溶栓，美國(guó)FDA批準(zhǔn)的唯一溶栓藥物是組織纖溶酶原激活劑（ tissue plasminogen activator, tPA），治療時(shí)間

3、窗僅為腦卒中發(fā)病后4.5小時(shí)，因此絕大多數(shù)患者得不到有效救治。幾十年來(lái)全球醫(yī)生和科學(xué)家們一直致力于神經(jīng)保護(hù)藥物的研究，雖然這些藥物在實(shí)驗(yàn)室研究中取得了巨大進(jìn)展，但是在后期的臨床試驗(yàn)中都失敗了。尋找治療缺血性腦卒中的新策略和新藥物是腦卒中研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)，缺血缺氧可促進(jìn)機(jī)體發(fā)生代償性血管新生，但過(guò)程緩慢，作用很弱。通過(guò)給予藥物促進(jìn)腦缺血局部血管新生，建立新的循環(huán)通路以有效緩解缺血引起的神經(jīng)損傷，并對(duì)神經(jīng)再生

4、及神經(jīng)功能恢復(fù)產(chǎn)生治療作用，這種方法就是治療性血管新生，治療性血管新生有望成為臨床治療缺血性腦卒中的新策略。我室前期研究報(bào)道血管內(nèi)皮細(xì)胞存在α7 nAChR，參與血管新生調(diào)節(jié)，其激動(dòng)劑膽堿，能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及體外血管索形成，促進(jìn)心梗組織側(cè)枝循環(huán)的建立。提出α7 nAChR可能是治療心腦血管缺血性疾病的新靶標(biāo)。膽堿是否可以促進(jìn)腦血管新生從而提供腦保護(hù)以治療缺血性腦卒中有待研究。本研究以永久性局灶性腦缺血大

5、鼠和低氧誘導(dǎo)下大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，觀(guān)察膽堿對(duì)缺血性腦卒中的治療作用及其血管新生相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　雄性SD大鼠（體重280±20g）隨機(jī)分為8組，每組18只，包括假手術(shù)組、膽堿50 mg/kg組、膽堿100 mg/kg組、膽堿200 mg/kg組、膽堿100 mg/kg+α7 nAChR選擇性阻斷劑MLA1 mg/kg組、MLA1 mg/kg組和陽(yáng)性對(duì)照藥尼莫地平20 mg/kg組。模型組和各給藥組大鼠采

6、用線(xiàn)栓法誘導(dǎo)右側(cè)大腦中動(dòng)脈永久性局灶性腦缺血，假手術(shù)組僅做血管分離，不插管，其余操作同手術(shù)組。所有藥物用注射用水溶解，膽堿和尼莫地平口服給藥，MLA采用皮下給藥，給藥量2 mL/kg，于手術(shù)后4 h給藥，以后每天一次，連續(xù)給藥10天。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)
　　測(cè)定144只大鼠10天的生存率和體重；應(yīng)用Bederson評(píng)分評(píng)估神經(jīng)功能缺損；應(yīng)用雙前肢抓握實(shí)驗(yàn)和平衡木實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠的行為學(xué)能力；pMCAO后10 d大鼠麻醉處

7、死后迅速取腦，大腦冠狀位切片應(yīng)用 TTC染色測(cè)定腦梗死體積；梗死側(cè)大腦拍照后測(cè)定腦表面血管長(zhǎng)度和面積用于觀(guān)察缺血腦表面血管新生情況；腦石蠟切片HE染色觀(guān)察病理形態(tài)學(xué)改變；切片經(jīng)CD34免疫組化及CD34/PCNA免疫熒光染色觀(guān)察大鼠缺血腦皮質(zhì)微血管新生情況；測(cè)定血清NO和VEGF水平；Real-time PCR和Western blot檢測(cè)缺血腦皮質(zhì)α7 nAChR，HIF-1α，eNOS，iNOS和VEGF基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。

8、r>　　3.大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
　　取3周齡大鼠腦用改良膠原酶/分散酶消化法培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將2～3周齡大鼠腦皮質(zhì)剪碎、勻漿，然后先后通過(guò)200μm和77μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，濾網(wǎng)上組織應(yīng)用0.1%膠原酶/分散酶37℃消化25 min，沉淀中加入25% BSA-DMEM中1000×g，梯度離心20 min分離微血管層。分離的微血管加入完全DMEM培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)于5% CO2培養(yǎng)箱中，完全培養(yǎng)基成

9、分包括：20% FBS，100μg/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，100μg/mL肝素鈉，3.75 mg/mL HEPS，0.2 U/mL胰島素，0.3 mg/mL L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，pH7.2–7.4。細(xì)胞應(yīng)用CD34抗體免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定陽(yáng)性，第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。
　　4.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)
　　在低氧（1%O2、95%CO2）培養(yǎng)條件下，運(yùn)用小干擾RNA技術(shù)（small-inter

10、fering-RNA， siRNA）沉默 HIF-1α基因，應(yīng)用 MTS試劑盒檢測(cè)膽堿對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用；應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膽堿對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用；應(yīng)用Matrigel基質(zhì)膠使內(nèi)皮細(xì)胞形成血管索，檢測(cè)膽堿對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管作用影響；應(yīng)用NO生化試劑盒和VEGF ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液NO和VEGF水平。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（無(wú)膽堿DMEM）；膽堿1μM組；膽堿10μM組；膽堿100μM；膽堿100μM+M

11、LA1μM組；MLA1μM組；膽堿10μM+HIF-1αsiRNA100 nmol/L組。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，各組均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni’s檢驗(yàn)，P＜0.05作為差異有顯著性。
　　結(jié)果：
　　第一部分膽堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用及其血管新生機(jī)

12、制
　　1.膽堿增加pMCAO大鼠生存率，改善體重和神經(jīng)功能
　　大鼠pMCAO后10天，與假手術(shù)組相比，大鼠生存率降到60%。膽堿50～200 mg/kg給藥10天，提高生存率到67%～80%，但是α7 nAChR選擇性阻斷劑MLA1 mg/kg能夠阻斷膽堿100 mg/kg的作用。大鼠pMCAO后10天，體重明顯減輕，給予膽堿治療后體重明顯增加。應(yīng)用Bederson評(píng)分連續(xù)10天評(píng)定大鼠神經(jīng)功能缺損，模型組Bederso

13、n評(píng)分顯著增加，100和200 mg/kg膽堿給藥7～10天明顯改善神經(jīng)功能缺損；應(yīng)用雙側(cè)前肢抓握和平衡木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)定大鼠前肢肌力和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)反射和協(xié)調(diào)能力，膽堿治療可以劑量依賴(lài)性提高大鼠肌力，但是膽堿對(duì)大鼠平衡木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分沒(méi)有顯著改變；膽堿的這些作用能夠被MLA所阻斷。
　　2.膽堿減少pMCAO大鼠腦梗死體積和神經(jīng)細(xì)胞死亡
　　大鼠pMCAO后10天，腦梗死體積明顯增加；膽堿治療10天，能夠劑量依賴(lài)性降低腦梗死體積；但是

14、膽堿的作用能夠被MLA所完全阻斷；在腦切片HE染色圖像中，模型組大鼠可見(jiàn)許多死亡的神經(jīng)細(xì)胞，同時(shí)伴有核固縮、腫脹和空泡化；膽堿能夠顯著改善這些病理學(xué)改變；MLA能夠阻斷膽堿的作用。
　　3.膽堿促進(jìn)缺血腦組織血管新生
　　大鼠pMCAO后10天，檢測(cè)膽堿對(duì)腦缺血表面和腦缺血組織半影區(qū)血管新生情況。與假手術(shù)組相比，模型組腦表面血管數(shù)量明顯增加，膽堿能夠劑量依賴(lài)性地促進(jìn)pMCAO大鼠腦缺血組織血管新生，總的血管長(zhǎng)度和血管面積與模

15、型組相比顯著性增加。CD34/PCNA免疫熒光雙染顯示新增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞，代表微血管密度。與模型組相比，膽堿100 mg/kg和200 mg/kg組CD34和PCNA共表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯增加。MLA能夠完全阻斷膽堿對(duì)pMCAO大鼠缺血腦組織促血管新生作用。CD34免疫組化結(jié)果與之一致。尼莫地平和膽堿作用不一致，不能夠促進(jìn)缺血腦組織血管新生。
　　4.膽堿提高pMCAO大鼠血清NO和VEGF水平
　　pMCAO后10天，測(cè)定大鼠

16、血清NO和VEGF水平。與假手術(shù)組比較，模型組血清NO水平明顯降低，但是VEGF水平?jīng)]有明顯改變。100～200 mg/kg膽堿給藥10天均能顯著增加血清NO和VEGF的水平，這一作用能夠被MLA所阻斷。尼莫地平增加NO水平，但對(duì)VEGF水平?jīng)]有明顯影響。
　　5.膽堿對(duì)pMCAO大鼠缺血腦皮質(zhì)相關(guān)基因和蛋白的影響
　　大鼠pMCAO后10天，應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)缺血腦皮質(zhì)相關(guān)基因和蛋

17、白表達(dá)水平。與假手術(shù)組相比，模型組α7 nAChR、HIF-1α和VEGF mRNA水平明顯上調(diào)，然而eNOS mRNA顯著下調(diào)，iNOS mRNA沒(méi)有明顯改變。100 mg/kg治療10天顯著增加α7 nAChR、HIF-1α、eNOS和VEGF mRNA水平，但是對(duì)iNOS基因沒(méi)有明顯改變。1 mg/kg MLA能夠阻斷膽堿的上述作用，但是其本身沒(méi)有直接作用。各組α7 nAChR、HIF-1α、eNOS、iNOS和VEGF蛋白表達(dá)水

18、平結(jié)果與基因表達(dá)結(jié)果基本上一致。
　　第二部分膽堿對(duì)低氧條件下rBMECs的影響
　　1.膽堿促進(jìn)rBMECs增殖、遷移和小管形成
　　在1%的低氧條件下孵育24 h，與對(duì)照組相比，1～100μM膽堿能夠濃度依賴(lài)性地促進(jìn)rBMECs增殖，細(xì)胞遷移和血管索形成；1μM MLA和100 nmol/L HIF-1αsiRNA能夠阻斷10μM膽堿的上述作用，并且不產(chǎn)生直接作用，提示膽堿是通過(guò)激活α7 nAChR上調(diào)HIF-1α

19、表達(dá)促進(jìn)rBMECs增殖、遷移和小管形成。
　　2.膽堿增加rBMECs培養(yǎng)液中NO和VEGF水平
　　低氧條件下，給藥24 h后測(cè)定rBMECs培養(yǎng)上清液中NO和VEGF水平。與對(duì)照組相比，1～100μM膽堿能夠濃度依賴(lài)性地提高NO和VEGF水平。MLA能夠阻斷膽堿促rBMECs分泌NO和VEGF；HIF-1α siRNA能夠阻斷膽堿促rBMECs分泌VEGF但是對(duì)NO分泌無(wú)明顯影響。提示膽堿促進(jìn)rBMECs分泌VEGF與

20、激活α7 nAChR和HIF-1α同時(shí)相關(guān)；而促進(jìn)NO分泌僅與激活α7 nAChR相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.膽堿通過(guò)激活α7 nAChR促進(jìn)pMCAO大鼠缺血腦組織血管新生，形成側(cè)枝循環(huán)，從而提高大鼠生存率，減少腦梗死體積，改善體重和神經(jīng)行為學(xué)功能。
　　2.膽堿治療大鼠缺血性腦卒中的血管新生作用與上調(diào)腦組織α7 nAChR，HIF-1α，eNOS和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)，提高血清VEGF和NO水平有關(guān)。