胸腺素β4優(yōu)化內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究.pdf

1、目前，缺血性心血管疾病的發(fā)病率和致死率逐年上升，嚴(yán)重危害人類健康。其發(fā)病制十分復(fù)雜，其中內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是導(dǎo)致缺血性心血管病的重要環(huán)節(jié)。雖然成熟內(nèi)皮細(xì)胞能夠修復(fù)損傷內(nèi)皮，但是其再生能力有限。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能。大量研究表明，EPCs在血管修復(fù)和新生中發(fā)揮多種作用。但是，目前EPCs移植在臨床應(yīng)用仍面臨諸多問(wèn)題，多種心血管疾

2、病或心血管疾病危險(xiǎn)因素諸如老齡、高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病等會(huì)減少循環(huán)EPCs數(shù)目，并損害EPCs的功能，這很大程度上限制了EPCs在缺血性心血管疾病中的應(yīng)用。因此，改善EPCs功能將是未來(lái)EPCs移植治療的重要策略。
　　胸腺素β4(thymosinβ4，Tβ4)，是一種由43個(gè)氨基酸殘基組成的小分子量蛋白，它介導(dǎo)了多種生物學(xué)反應(yīng)，如血管新生、創(chuàng)傷愈合、炎癥控制等。我們此前的研究發(fā)現(xiàn)Tβ4能夠增強(qiáng)人外周血EPCs的增殖、遷移，

3、并抑制人外周血EPCs的凋亡和衰老，但是Tβ4對(duì)于循環(huán)EPCs的成血管功能、旁分泌功能以及Tβ4預(yù)處理EPCs后進(jìn)行移植是否能進(jìn)一步提高EPCs移植治療的療效目前尚不明確。
　　基于上述考慮，我們首先觀察了體外實(shí)驗(yàn)中Tβ4對(duì)EPCs成血管功能的影響及相關(guān)機(jī)制;其次我們研究了Tβ4對(duì)EPCs旁分泌的作用;最后我們進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究了Tβ4預(yù)處理EPCs后進(jìn)行移植是否能進(jìn)一步提高EPCs移植治療的療效。以下分三部分對(duì)本研究的方法、結(jié)果

4、及結(jié)論分別簡(jiǎn)述。
　　第一部分 胸腺素β4對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管功能的影響
　　目的:觀察Tβ4體外干預(yù)對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管功能的影響及相關(guān)機(jī)制
　　方法:采用密度梯度離心法從人外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，接種于人纖維連接蛋白(HFN)包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d后，收集貼壁細(xì)胞，采用FITC-UEA-I和DiI-acLDL染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，雙染陽(yáng)性細(xì)胞鑒定為正在分化的EPCs。加入不同濃度的Tβ4(10ng/m

5、L，100ng/mL和1000ng/mL)干預(yù)，采用Matrigel膠體外成血管能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)觀察EPCs的成血管能力。Western blot檢測(cè)EPCs Akt Ser473和eNOS Ser1177的磷酸化水平。隨后，在分別加入Akt siRNA及eNOS siRNA干擾后，再予1000ng/mL Tβ4干預(yù)，再次采用Matrigel膠體外成血管能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)觀察不同實(shí)驗(yàn)組EPCs的成血管能力。
　　結(jié)果:Tβ4能明顯增加EPC

6、s的成血管能力，并呈一定的量效關(guān)系，在1000ng/mL達(dá)到最大效應(yīng)（與對(duì)照組比較，33.33±1.86 vs18.34±2.02，P＜0.05）。Westemblot檢測(cè)顯示Tβ4能促進(jìn)Akt Ser473及eNOS Ser1177的磷酸化，且呈一定的量效關(guān)系。Akt siRNA及eNOS siRNA均顯著抑制了Tβ4促進(jìn)EPCs成血管的作用。
　　結(jié)論:Tβ4可增強(qiáng)EPCs的體外成血管功能，且呈一定的量效關(guān)系。Akt/eNOS

7、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與對(duì)Tβ4促進(jìn)EPCs體外成血管能力的調(diào)控。
　　第二部分 胸腺素β4對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞旁分泌作用的研究
　　目的:觀察Tβ4影響外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞旁分泌功能的影響及相關(guān)機(jī)制
　　方法:分離和獲取外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)方法同前。加入不同濃度的Tβ4(10ng/mL，100ng/mL和1000ng/mL)干預(yù)，采用熒光定量PCR檢測(cè)EPCs內(nèi)VEGF和IL-8的表達(dá)，采用ELISA試劑盒檢測(cè)EPCs條件培

8、養(yǎng)基(EPCs-derived conditionedmedium，EPCs-CM)中VEGF和IL-8的表達(dá)。采用Transwell細(xì)胞遷移檢測(cè)和Matrigel膠毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成分別檢測(cè)EPCs-CM、Tβ4-EPCs-CM及Tβ4-EPCs-CM加入中和性抗體（VEGF和IL-8中和性抗體）干預(yù)之后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilical vein endothelial cells，HUVECs)體外遷移和成血管能力。在

9、分別加入AktsiRNA及eNOS siRNA干擾后，再予1000ng/mLTβ4干預(yù)，采用ELISA試劑盒檢測(cè)EPCs-CM中VEGF和IL-8的表達(dá)。
　　結(jié)果:Tβ4干預(yù)能明顯增加EPCs內(nèi)和EPCs-CM中VEGF和IL-8的表達(dá)，EPCs-CM能夠顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞遷移和成血管作用，Tβ4干預(yù)能進(jìn)一步增強(qiáng)EPCs-CM對(duì)內(nèi)皮功能的影響，而VEGF和IL-8的中和性抗體可以分別拮抗Tβ4對(duì)EPCs-CM促內(nèi)皮遷移和成血管的增

10、強(qiáng)效應(yīng)。Akt siRNA可以顯著降低Tβ4-EPCs-CM中VEGF和IL-8的表達(dá);eNOS siRNA可以顯著降低Tβ4-EPCs-CM中VEGF而非IL-8的表達(dá)。
　　結(jié)論:Tβ4能夠促進(jìn)EPCs的旁分泌作用，增加EPCs內(nèi)和EPCs-CM中VEGF和IL-8的表達(dá)，且這一作用與Akt/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。
　　第三部分 胸腺素β4對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞移植作用的影響
　　目的:觀察Tβ4對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞移

11、植作用的影響
　　方法:分離和獲取外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)方法同前。采用前降支結(jié)扎法建立大鼠心肌梗死模型，按不同分組分別將150μL培養(yǎng)基、1×106個(gè)EPCs及相同數(shù)量的經(jīng)Tβ4預(yù)處理24小時(shí)后的EPCs采用心肌注射的方法移植于心臟缺血區(qū)。心梗4周后采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠的心臟功能，組織切片免疫熒光檢測(cè)心梗缺血邊緣區(qū)血管密度及移植EPCs駐留和參與血管修復(fù)情況;組織切片免疫組化及組織蛋白電泳檢測(cè)缺血區(qū)VEGF的表達(dá)及組織纖維