僵蠶炮制前后蛋白質(zhì)的差異研究.pdf

1、動物藥僵蠶是蠶蛾科昆蟲家蠶4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌而致死的干燥體，作為傳統(tǒng)的中藥材，使用歷史悠久。僵蠶具有抗驚厥、抗癲癇、抗凝等藥理作用，臨床主要用于治療驚厥、癲癇、抽搐等。僵蠶飲片有生品和炮制品之分，由于生品具有較強(qiáng)毒性，臨床一般使用炮制品，即麩炒品。僵蠶經(jīng)炮制后，毒性大大減弱，近年來對其毒性的分析往往針對其中的小分子物質(zhì)，且至今沒有定論，而主要的成分蛋白質(zhì)尚未被深入研究。本論文主要分析僵蠶炮制前后蛋白質(zhì)的變化，明確僵蠶

2、炮制前后的差異性蛋白質(zhì)，為研究僵蠶的炮制減毒機(jī)理提供依據(jù)。研究內(nèi)容分為以下幾個(gè)部分：
　　1.首先將僵蠶生品炮制成麩炒僵蠶，并對僵蠶中蛋白質(zhì)的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，最終確立以水為溶劑，料液比為1:50，超聲提取50 mins為最佳方法。用此方法分別提取僵蠶生品、自制炮制品和市售炮制品的蛋白質(zhì)，并測定了蛋白質(zhì)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：僵蠶生品的蛋白含量明顯高于炮制品，而自制僵蠶炮制品蛋白質(zhì)含量略高于市售炮制品。
　　2.對僵蠶生品以及炮制

3、品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，使用氨基酸分析儀對產(chǎn)生的氨基酸進(jìn)行了含量測定，發(fā)現(xiàn)兩者的氨基酸組成一致，氨基酸的含量分布趨勢一致，且除甲硫氨酸外，僵蠶生品中其余氨基酸的含量均高于炮制品。
　　3.使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析僵蠶中的蛋白質(zhì)，考察了不同的分離膠濃度、電泳電壓對蛋白質(zhì)分離效果的影響，并對僵蠶生品和炮制品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：僵蠶生品的蛋白質(zhì)條帶明顯多于炮制品（未觀察到明顯蛋白質(zhì)條帶）。此外，將僵蠶的自

4、制炮制品和市售炮制品進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)兩者差異不大。
　　4.運(yùn)用二維凝膠電泳（2-DE）進(jìn)一步分析了僵蠶生品與炮制品中蛋白質(zhì)的差異?？疾炝瞬煌姆蛛x膠濃度、染色方法以及蛋白質(zhì)純化方法對蛋白質(zhì)分離效果的影響，并比較了僵蠶生品和炮制品的二維電泳圖譜。結(jié)果表明：僵蠶生品電泳圖譜上的蛋白斑點(diǎn)明顯多于其炮制品（幾乎沒有斑點(diǎn)）；但是，用飽和硫酸銨沉淀法純化樣品后，僵蠶炮制品的蛋白斑點(diǎn)少于其生品，主要靠近中性端。
　　5.分別以SDS-

5、PAGE分離得到的蛋白質(zhì)條帶和2-DE分離得到的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為來源，用胰蛋白酶膠內(nèi)消化，將消化得到的多肽混合物進(jìn)一步用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析，得到對應(yīng)多肽片段的指紋圖譜，并導(dǎo)入到Mascot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以SDS-PAGE條帶為來源，僅鑒定得到一個(gè)可信度較高的蛋白質(zhì)；而以2-DE斑點(diǎn)為來源，經(jīng)過分析后未能鑒定出可信度較高的蛋白質(zhì)。
　　6.將以上樣品進(jìn)一步用納升液相色譜-電噴