丙型肝炎病毒體外培養(yǎng)模型的建立及其感染的關(guān)鍵因子研究.pdf

1、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）屬黃病毒科，是單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約9.6Kb，兩端是空間結(jié)構(gòu)保守的非編碼區(qū)，中間是一個(gè)可以編碼約3000個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體的開(kāi)放閱讀框。HCV感染后慢性化程度高，并且可引發(fā)嚴(yán)重的肝損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化以及肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重肝病。HCV被發(fā)現(xiàn)后30年以來(lái)，隨著科學(xué)研究的逐漸深入，其防治也取得了一些重要的進(jìn)展，如小分子直接抗病毒藥物的研發(fā)取得的重大突破；然而

2、，我們也應(yīng)該看到目前HCV新藥都是由國(guó)外研發(fā)且價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)的慢性 HCV感染者都難以承受?？紤]到這些原因以及 HCV感染后病情發(fā)展的隱匿性，有效的疫苗對(duì)HCV感染的控制仍然極為重要。
　　在HCV的防治研究過(guò)程中，細(xì)胞模型的地位十分重要，它極大的促進(jìn)了基礎(chǔ)研究和新藥開(kāi)發(fā)。然而即使目前最常用的肝癌細(xì)胞系培養(yǎng)模型也存在感染效率低、不能被臨床毒株感染等諸多不足。因此，發(fā)展可以較好地支持細(xì)胞培養(yǎng)HCV和臨床HCV毒株感染并產(chǎn)生與

3、體內(nèi)感染相似的過(guò)程和反應(yīng)，具有可重復(fù)性、可控性和可靠性并符合倫理學(xué)要求的細(xì)胞模型是目前HCV模型的主要發(fā)展方向。理想的細(xì)胞模型建立，將為深入研究病毒的致病機(jī)制、病毒與宿主相互作用、病毒變異性以及抗病毒藥物的篩選和預(yù)防疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　本研究基于以上的分析提出：利用具有干細(xì)胞功能的人胚胎肝干細(xì)胞（human Fatal liver stem cells, hFLSCs）建立高效的血清來(lái)源的HCV（blood-borne HC

4、V, bbHCV）培養(yǎng)系統(tǒng)。在此系統(tǒng)中模擬bbHCV體內(nèi)感染過(guò)程中的吸附、侵入、RNA復(fù)制、蛋白質(zhì)合成、病毒組裝和分泌以及子代病毒再感染的整個(gè)生命過(guò)程；利用數(shù)學(xué)模型闡述病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖和分泌規(guī)律；觀察類似于HCV慢性感染者體內(nèi)的細(xì)胞病變并初步闡明其機(jī)制；利用此系統(tǒng)對(duì)已有的抗病毒藥物進(jìn)行效果評(píng)價(jià)；利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在此系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證除目前已有的HCV感染相關(guān)受體之外的新的感染關(guān)鍵因子：受體蛋白酪氨酸磷酸酶A（Protein tyros

5、ine phosphatases, receptor type A, PTPRA）和載脂蛋白D（Apolipoprotein D, ApoD），并探討其在病毒侵入、復(fù)制、組裝和分泌過(guò)程中的機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　首先，以目前常用的免疫磁珠分離方法為對(duì)照，利用兩步原位灌流、IV型膠原酶消化、冰上重力沉淀、Percoll密度梯度離心相結(jié)合的方法（簡(jiǎn)稱CSP）分離了高純度、高增殖活性的hFLSCs。所獲得的細(xì)胞分離3~5天之后開(kāi)始

6、增殖呈鋪路石樣小細(xì)胞，10天之后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而免疫磁珠分離的細(xì)胞需要花費(fèi)2周形成單克隆，第3周才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；并且凍存不影響分離細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞表面標(biāo)志物以及基因表達(dá)譜。細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)譜和基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)兩種方法分離的hFLSCs在最初的10代培養(yǎng)過(guò)程中并無(wú)顯著性差異。當(dāng)細(xì)胞傳至20代時(shí)，免疫磁珠分離的細(xì)胞表面 EpCAM、c-kit、CD44和OV-6這幾種干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)明顯低于CSP所分離的細(xì)胞；兩種方法分離的細(xì)

7、胞c-kit、EpCAM、CK19、NCAM和CLDN3的mRNA表達(dá)譜在細(xì)胞傳代過(guò)程中表現(xiàn)一致，成熟肝細(xì)胞特異性基因PEPCK、TRF、CX26和C3A4在兩種方法所分離的細(xì)胞之間沒(méi)有顯著性差異，AFP和ALB的mRNA表達(dá)水平在15到20代之間，免疫磁珠分離細(xì)胞較之CSP分離細(xì)胞高。體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) hFLSCs可以定向分化為功能性肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。
　　其次，我們利用hFLSCs建立了一個(gè)能完整模擬bbHCV感染細(xì)胞并在其中

8、繁殖的整個(gè)生命過(guò)程的培養(yǎng)系統(tǒng)，可以模擬包括病毒的吸附和侵入、RNA復(fù)制、蛋白質(zhì)合成、病毒組裝、有感染性的病毒顆粒的分泌以及特殊的類似于HCV慢性感染者體內(nèi)的肝細(xì)胞病變。利用3D-SIM熒光顯微鏡展示了HCV E2蛋白和細(xì)胞表面CD81受體的結(jié)合過(guò)程，而其特異的抗體則可以降低病毒的感染效率。此結(jié)果表明了hFLSCs可以模擬bbHCV自然感染的吸附和侵入。負(fù)鏈RNA的發(fā)現(xiàn)說(shuō)明了bbHCV可以在hFLSCs中進(jìn)行RNA的復(fù)制，細(xì)胞表面特異的H

9、CV蛋白的檢出則表明病毒可以在細(xì)胞內(nèi)完成蛋白的翻譯合成。進(jìn)一步的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)hFLSCs可以培養(yǎng)不同基因型的bbHCV（1a,1b,2a和3a型），特別是目前難培養(yǎng)的1b型HCV。病毒RNA復(fù)制可以部分的被Peginterferonα-2a和直接抗病毒藥物抑制，預(yù)示著這個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)可以被用于抗病毒藥物的篩選和評(píng)價(jià)。感染后的hFLSCs可以分泌出有感染性的子代病毒顆粒，通過(guò)動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算，我們得出bbHCV在hFLSCs內(nèi)部的倍增時(shí)間大約是2

10、h。利用普通和免疫電子顯微鏡：在bbHCV感染后的細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)液中均發(fā)現(xiàn)典型的55nm左右的病毒粒子；bbHCV感染可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張紊亂、線粒體腫脹以及細(xì)胞空泡化形成等細(xì)胞病變，這些病變和HCV慢性感染者體內(nèi)的肝細(xì)胞病變類似。病變的機(jī)制可能為在感染的早期bbHCV誘導(dǎo)ER（Endoplasmic reticulum）應(yīng)激和線粒體相關(guān)的caspase依賴的細(xì)胞凋亡；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NF-κB激活、bcl-XL表達(dá)增強(qiáng)，接著PI3-kina

11、se-Akt/PKB細(xì)胞增殖通路和 p53抗凋亡通路激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡被抑制。同時(shí)，我們?cè)赽bHCV感染過(guò)程中發(fā)現(xiàn)固有免疫相關(guān)基因ISGs和miRNA（miRNA-21和miRNA-122）均被誘導(dǎo)升高，而敲除或轉(zhuǎn)入miRNA-21或miRNA-122則能抑制或增強(qiáng)bbHCV的復(fù)制，此結(jié)果表明了hFLSCs可以被用來(lái)研究病毒與宿主的相互作用，并為HCV的感染機(jī)制研究和治療提供新思路。
　　最后，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

12、結(jié)合生物信息學(xué)分析，最終篩選和發(fā)現(xiàn)PTPRA和ApoD與bbHCV感染密切相關(guān)。針對(duì)目前已經(jīng)鑒定出的HCV特異性受體CD81、SR-BI、NPC1L1和EGFR，利用siRNA干涉后，可以部分降低bbHCV的感染效率。針對(duì)新鑒定的PTPRA和ApoD，bbHCV感染后RT-qPCR檢測(cè)PTPRA和ApoD的表達(dá)發(fā)現(xiàn)其明顯升高；siPTPRA可以降低病毒進(jìn)入細(xì)胞的量，siApoD則減少了感染后病毒向細(xì)胞外分泌的量，但是細(xì)胞內(nèi)病毒 RNA卻

13、累積增高；并且 bbHCV感染后可激活胰島素信號(hào)通路，增加IRS和JNK的磷酸化，最終激活A(yù)kt導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成增加，細(xì)胞內(nèi)脂滴增多。PTPRA抑制劑Peroxyacid可以降低bbHCV及其子代病毒在hFLSCs和Huh-7.5.1中的感染，而PTPRA激動(dòng)劑胰島素和TNF-α則作用相反。通過(guò)構(gòu)建PTPRA和ApoD表達(dá)質(zhì)粒（pEGFP-N1），發(fā)現(xiàn)bbHCV感染轉(zhuǎn)染PTPRA成功的hFLSCs后，病毒進(jìn)入細(xì)胞的速率增加，達(dá)到平臺(tái)

14、期的時(shí)間縮短；而感染轉(zhuǎn)染ApoD的hFLSCs，可以觀察到病毒向細(xì)胞外分泌的速率增加，細(xì)胞外病毒可以在感染后18h到達(dá)平臺(tái)期，較之未轉(zhuǎn)染的24h有顯著差異。利用所構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì) bbHCV不感染的肝源 Huh-7和非肝源 vero細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)：Huh-7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染了PTPRA之后雖然對(duì)bbHCV表現(xiàn)出有一定的感染性，但是細(xì)胞分泌病毒的含量依然很低，而單獨(dú)轉(zhuǎn)染ApoD并未對(duì)Huh-7感染bbHCV有所改善；有趣的是vero細(xì)胞中表達(dá)PTP

15、RA可以使這一株完全不感染bbHCV的細(xì)胞對(duì)bbHCV產(chǎn)生感染性，但可惜的是感染后在細(xì)胞上清中只能檢測(cè)到104~105Copies/mL的病毒RNA。上述結(jié)果表明我們發(fā)現(xiàn)的PTPRA可能是bbHCV感染必要的一個(gè)輔助因子。
　　綜上所述，本研究致力于建立一個(gè)能對(duì)bbHCV整個(gè)生命過(guò)程進(jìn)行模擬的體外細(xì)胞感染模型，解決目前缺乏能穩(wěn)定、有效模擬bbHCV自然感染過(guò)程的細(xì)胞模型的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題，在此基礎(chǔ)之上針對(duì)bbHCV感染的機(jī)制及關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)