新的丙型肝炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)模型建立的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建一種新的含有HCV全長基因以及熒光素酶基因的真核表達(dá)質(zhì)粒及其復(fù)制缺陷質(zhì)粒，直接轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，通過熒光素酶檢測HCV RNA在細(xì)胞內(nèi)是否有表達(dá)并在一定程度上對HCVRNA水平定量，建立一種新的實用方便的HCV細(xì)胞培養(yǎng)研究模型。
　　 方法:
　　 1.用基因克隆方法，在HCV全長基因復(fù)制子質(zhì)粒中插入螢火蟲熒光素酶基因片段LUC，體外構(gòu)建含螢火蟲熒光素酶基因和HCV全長基因的雙順反子重組HCV復(fù)制子真核

2、表達(dá)質(zhì)粒，在此質(zhì)粒基礎(chǔ)上切除包含HCV NS5B端RNA多聚酶活性位點在內(nèi)的18個核苷酸，構(gòu)建復(fù)制缺陷型重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析和測序分析重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的復(fù)制缺陷重組質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。
　　 2.重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的復(fù)制缺陷重組質(zhì)粒采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。
　　 3.發(fā)光檢測儀檢測轉(zhuǎn)染后HEK-293T細(xì)胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶數(shù)值。
　　 4.分別以HCV正負(fù)鏈引物行RT-PCR半定量檢測轉(zhuǎn)染后

3、HEK-293T細(xì)胞中HCV RNA的表達(dá)和復(fù)制5.熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)基中HCV RNA的量。
　　 結(jié)果:
　　 1.質(zhì)粒酶切和測序證明正確構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒和相應(yīng)的復(fù)制缺陷重組質(zhì)粒。
　　 2.轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞以HCV正、負(fù)鏈引物行RT-PCR，均能擴(kuò)增出目的條帶，表明重組真核表達(dá)質(zhì)粒能在HEK-293T細(xì)胞中正確轉(zhuǎn)錄HCV RNA并進(jìn)行有效復(fù)制，細(xì)胞培養(yǎng)基HCV RNA水平高達(dá)1

4、08IU/ml。
　　 3.轉(zhuǎn)染復(fù)制缺陷重組質(zhì)粒組細(xì)胞僅正鏈引物擴(kuò)增出明顯條帶，負(fù)鏈引物不能擴(kuò)增出目的條帶，顯示復(fù)制缺陷重組質(zhì)粒能在HEK-293T細(xì)胞中正確轉(zhuǎn)錄HCV RNA但不能有效復(fù)制，細(xì)胞培養(yǎng)基中HCV RNA水平小于500IU/ml。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒和相應(yīng)的復(fù)制缺陷重組質(zhì)粒并證實其能在HEK-293T細(xì)胞表達(dá)，為在HCV細(xì)胞培養(yǎng)模型中進(jìn)一步研究HCV的致病機(jī)制和篩選抗HCV藥物提供了有效