丙型肝炎病毒體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立和超微結構觀察及受體介導的入胞作用研究.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）所致的丙型肝炎易于慢性化，是引起慢性肝病的主要原因之一。目前全球約有1.7億HCV感染者。丙型肝炎與肝硬化、肝細胞癌的發(fā)生密切相關，嚴重危害人類健康，已成為全球性的、重要的公共衛(wèi)生問題。迄今，HCV感染發(fā)病的機制尚不完全清楚，仍然缺乏有效的治療方法，疫苗的研究也遇到很大障礙。
　　HCV是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬。包膜病毒感染細胞的初始步驟

2、即是病毒外膜與靶細胞膜結合并相互作用的過程，目前初步認為低密度脂蛋白受體（LDLR）、CD81、B族I型清道夫受體（SR-BI），claudin-1等多種宿主細胞膜分子參與其中，但由于一直以來都缺乏合適的研究模型，這些分子的角色認定尚缺乏有力證據，其具體作用機制也不十分清楚。而深入研究論證HCV入胞相關的宿主因子，有助于加深對HCV感染發(fā)病機制的理解，為抗病毒治療尋找新的靶點。HCV進入細胞后，通過復制，合成，裝配等過程最終釋放出成熟的

3、病毒顆粒。理論上完整的包膜病毒顆粒由核衣殼及外膜組成，但由于獲取HCV顆粒存在一定困難且不同來源的病毒顆粒在大小和形態(tài)上存在顯著差異，目前對HCV顆粒的超微形態(tài)結構尚無定論。因此，進一步了解HCV顆粒在感染細胞中的形態(tài)和分布特征及感染細胞自身結構的病理改變，有利于更加直觀的認識病毒的生命周期及其在復制成熟過程中與哪些宿主細胞結構存在緊密聯(lián)系，為尋找更有效抑制病毒感染的新途徑提供依據。
　　2005年Rockefeller大學HCV

4、研究中心主任Charles M.Rice教授領導的實驗室建立了HCV細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，在一定程度解決了長期制約HCV研究的缺乏理想模型這一瓶頸問題。在Rice實驗室的幫助和指導下，我們構建了丙型肝炎病毒體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（HCV cell-culture system,HCVcc）。以此系統(tǒng)為平臺，我們對HCV顆粒在感染細胞中的超微形態(tài)及感染細胞自身的病理改變進行觀察研究，并進一步論證了CD81和SR-BI兩種宿主表面分子在HCV感染中的重要

5、作用。
　　本實驗主要完成了以下三個方面的工作：
　　1、HCV細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立與鑒定
　　將Rice教授惠贈的含有全長HCV嵌合基因組的質粒pFL-J6/JFH體外轉錄為HCVRNA，電穿孔轉染至Huh-7.5細胞，檢測轉染細胞中HCVmRNA及蛋白的表達，測定轉染后細胞培養(yǎng)上清中的病毒數(shù)量；收獲細胞培養(yǎng)上清孵育原始（naive）Huh-7.5細胞，測定并計算培養(yǎng)上清中HCV的感染性。實驗結果顯示：轉染細胞內有HC

6、VmRNA及蛋白表達，細胞培養(yǎng)上清中含有高水平的病毒拷貝數(shù)，感染性測定培養(yǎng)上清的TCID50/ml為6.98×104。結果表明成功建立了HCV體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)并獲得有感染性的HCV。
　　2、HCVcc感染原始(naive)Huh7.5細胞的透射電鏡觀察
　　收獲轉染HCVRNA的細胞培養(yǎng)上清，與原始的Huh7.5細胞共孵育后制成超薄切片，透射電子顯微鏡觀察感染細胞內HCV的形態(tài)結構和分布特征，以及宿主本身結構的變化。用專業(yè)

7、軟件測量觀察到的HCV顆粒直徑及病毒感染細胞前后的細胞內質網管腔內徑，應用醫(yī)學統(tǒng)計軟件對測量數(shù)據進行分析。透射電子顯微鏡觀察到HCVcc感染后的Huh7.5細胞胞質中含有大量的球形病毒樣顆粒，直徑在33-52nm之間，且多分布在核周的粗面內質網附近；感染細胞內部出現(xiàn)黃病毒科病毒感染后的特征性改變，如粗面內質網數(shù)量增加，管腔擴張，胞質中出現(xiàn)空泡結構和含有大量HCV顆粒的包涵體等。形態(tài)學的研究不僅進一步證明了HCV細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的可靠性，也更

8、加直觀的顯示了HCV顆粒在肝源細胞內的形態(tài)分布特征及其與內質網的密切聯(lián)系。
　　3、siRNA干擾CD81及SR-BI的表達對HCVcc易感性的影響
　　使用化學合成的靶向CD81及SR-BI的siRNA序列分別轉染Huh-7.5細胞，抑制Huh7.5細胞表面分子CD81或SR-BI的表達，檢測轉染前后Huh-7.5細胞對HCVcc易感性的變化。結果顯示siRNA可有效的干擾CD81或SR-BI的表達，而CD81或SR-BI