MicroRNa-214在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中作用的研究.pdf

1、目的:骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是臨床最普遍、最常見的關(guān)節(jié)退行性疾病之一，常常受累于膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)，其中膝關(guān)節(jié)受累最常見。OA可能是由各種因素引發(fā)的全關(guān)節(jié)性疾病，其中關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的變化尤為明顯和重要，隨著其內(nèi)部任何結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的改變，都會(huì)影響全關(guān)節(jié)的內(nèi)部平衡穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。MicroRNAs（miRNAs，miR）已被發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。本研究探討不同分級(jí)的骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)

2、軟骨及軟骨下骨中miR-214的表達(dá)、分子基因水平等特點(diǎn)，研究miR-214的表達(dá)在OA發(fā)生和發(fā)展中的作用。
　　方法:(1)收集從2013年10月-2014年12月的行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后的原發(fā)性O(shè)A患者的脛骨平臺(tái)40例為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，觀察標(biāo)本脛骨平臺(tái)大體觀，按照膝關(guān)節(jié)OA的Outerbridge分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肉眼分級(jí)后，檢測(cè)各組軟骨及軟骨下骨中miR-214的表達(dá)水平。(2)取3天齡健康C57乳鼠20只，提取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后，對(duì)其進(jìn)

3、行IL-1β和antagomir-214的誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別檢測(cè)代表軟骨細(xì)胞功能相關(guān)基因的表達(dá)情況及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌情況。(3)40只C57隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(ACLT手術(shù)組和ACLT聯(lián)合antagomir-214組，每組10只)和對(duì)照組（假手術(shù)組和假手術(shù)聯(lián)合antagomir-214組，每組10只）。取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)染色、免疫組化染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等檢測(cè)。(4)2月齡新西蘭大白兔分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，與去細(xì)胞軟骨基質(zhì)支架制備

4、細(xì)胞-支架復(fù)合物。對(duì)照組單純細(xì)胞支架復(fù)合靜態(tài)培養(yǎng)1d，實(shí)驗(yàn)組于Instron生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，加以力學(xué)刺激(力學(xué)加載參數(shù)為3h/d，1Hz，壓縮量為10％)7，14，21，28d。
　　結(jié)果:(1)檢測(cè)不同Outbridge級(jí)別OA樣本后，軟骨中，所有樣本均有miR-214表達(dá)，各組表達(dá)水平呈逐漸上升趨勢(shì)(P＜0.05)。軟骨下骨中，miR-214的表達(dá)水平在Ⅲ級(jí)組明顯高于Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅳ級(jí)組(P＜0.05)。(2)軟骨細(xì)胞經(jīng)不同誘

5、導(dǎo)培養(yǎng)后，IL-1β組染色顯示隨著IL-1β誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，基質(zhì)染色陽性率逐漸降低。IL-1β+antagomir-214組基質(zhì)陽性染色率遞增。免疫組化染色顯示IL-1β組隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，COL-Ⅰ、COL-Ⅹ、MMP-13陽性顯色逐漸增加，COL-Ⅱ陽性顯色逐漸降低。IL-1β+antagomir-214組，COL-Ⅰ、COL-Ⅹ、MMP-13陽性染色逐漸降低。RT-PCR結(jié)果顯示IL-1β組COL-Ⅱ的表達(dá)水平逐漸降低;而COL

6、-Ⅰ、COL-Ⅹ、MMP-13的表達(dá)均逐漸升高，并且miR-214的表達(dá)也逐漸升高。IL-1β+antagomir-214組，COL-Ⅱ的表達(dá)水平逐漸升高;COL-Ⅰ、COL-Ⅹ、MMP-13的表達(dá)水平逐漸降低。(3)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果影像學(xué)顯示OA模型小鼠膝關(guān)節(jié)呈骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。miR-214的表達(dá)水平隨OA模型建立的時(shí)間逐漸升高(P＜0.05)。而關(guān)節(jié)腔注射antagomir-214后，病變對(duì)比未注射antagomir-214，骨質(zhì)增生

7、相對(duì)減少，關(guān)節(jié)退變程度較低。組織學(xué)染色顯示動(dòng)物模型建立后，軟骨細(xì)胞逐漸增生肥大，細(xì)胞外基質(zhì)染色逐漸減少。而ACLT+antagomir-214組中軟骨退變較ACLT組減少，細(xì)胞外基質(zhì)保留較多。免疫組化結(jié)果對(duì)照組軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原陽性著色均勻，而ACLT組軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原陽性著色逐漸減少，基質(zhì)丟失較多。ACLT+antagomir-214組中Ⅱ型膠原陽性染色相對(duì)較高，基質(zhì)丟失較少。(4)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞-支架復(fù)合物彈性模量

8、顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組切片番紅“O”染色見細(xì)胞-支架復(fù)合物的細(xì)胞外基質(zhì)中有大量蛋白聚糖形成，隨力學(xué)刺激時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。RT-PCR檢測(cè)示，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ，Ⅱ型膠原表達(dá)均高于對(duì)照組(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組中力學(xué)刺激21d時(shí)Ⅱ型膠原表達(dá)最高(P＜0.05);Ⅰ型膠原在力學(xué)刺激28d表達(dá)最高(P＜0.05)。隨著力學(xué)刺激時(shí)間延長(zhǎng)，miR-214表達(dá)在加載21天后逐漸升高。
　　結(jié)論:(1)miR-214的表達(dá)水平與骨性關(guān)節(jié)