慢性飲酒對小鼠膽紅素清除及結(jié)構(gòu)型雄甾烷受體表達的影響.pdf

1、目的：
　　研究酒精性肝病模型小鼠肝內(nèi)外膽紅素清除通路變化以及膽紅素代謝調(diào)控因子結(jié)構(gòu)型雄甾烷受體的表達情況，探索CAR激活對ALD小鼠膽紅素清除的作用，探討慢性酒精攝入對膽紅素清除的作用與CAR可能的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.酒精組和對照組小鼠分別喂以Lieber-DeCarli液體酒精(w/v)飼料以及等熱卡的對照飲食，構(gòu)建酒精性肝病模型小鼠。酒精組小鼠腹腔注射CAR激動劑苯巴比妥（DMSO溶解）或DMSO（陰性

2、對照），即分為對照組、酒精組、酒精+PB組、酒精+DMSO組。
　　2.摘眼球取血，檢測ALT、AST、ALP、總膽紅素、直接膽紅素等生化指標。
　　3.切取部分肝組織，行蘇木精-伊紅染色(H&E)及油紅染色，觀察肝組織病理變化。
　　4.采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測膽紅素肝內(nèi)及肝外清除通路OATP1A1、OATP1A4、OATP1B2、UGT1A1、MRP2表達以及結(jié)構(gòu)型雄甾烷受體CAR核內(nèi)蛋白及

3、總蛋白的表達。
　　5.采用Trizol提取肝腎總RNA，RT-PCR檢測膽紅素清除通路Oatp1a1，Oatp1a4, Oatp1b2, Ugt1a1，Mrp以及結(jié)構(gòu)型雄烷受體Car mRNA表達.
　　6.培養(yǎng)正常小鼠肝細胞系NCTC1469，取相同代數(shù)的肝細胞隨機分為正常組、酒精組、PB組、PB+酒精組。采用免疫熒光法觀察CAR在細胞內(nèi)的分布情況。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立酒精性肝病小鼠模型，檢測血清生

4、化指標示:與對照組相比，酒精組ALT、AST、ALP、膽紅素均升高(P值均＜0.05);PB激活CAR后，與酒精+DMSO陰性對照相比，酒精+PB組總膽紅素水平下降（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　2.H&E、油紅染色可見酒精組肝細胞腫大，氣球樣變，細胞核固縮，肝細胞大皰性、小皰性脂肪變性，酒精+PB組脂肪變性等病理損傷顯著改善。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示:與對照組比較，酒精組肝腎0ATP1A1、肝MRP2 mR

5、NA表達顯著減少，葡萄糖醛酸化酶UGT1A1 mRNA表達增多(P＜0.05);與陰性對照組相比，酒精+PB組肝內(nèi)Oatp1a1，Oatp1 a4, Ugt1a1的mRNA表達明顯增多（P值均＜0.05），腎臟OATP1A1，OATP1A4，MRP2轉(zhuǎn)運體mRNA改變均不明顯（P值均＞0.05）。
　　4.Western blot結(jié)果顯示:與對照組比較，酒精組肝腎OATP1A1、肝MRP2蛋白表達顯著減少，葡萄糖醛酸化酶UGT1A

6、1蛋白表達增多（P＜0.05），肝CAR總蛋白未見明顯改變(P＞0.05)，而CAR核蛋白明顯抑制，其表達量是對照組的60％（P＜0.05）;與陰性對照組相比，酒精+PB組肝內(nèi)UGT1A1蛋白表達顯著增加，是陰性對照組的2倍（P＜0.05）。腎臟OATP1A1，OATP1A4，MRP2轉(zhuǎn)運體蛋白改變均不明顯（P＞0.05），肝CAR總蛋白未發(fā)生改變，而肝CAR核蛋白表達增多，增加1.6倍(P＜0.05)。
　　4.免疫熒光法檢測C

7、AR在細胞內(nèi)的分布，結(jié)果示:與空白對照組相比，酒精組細胞核內(nèi)的紅色熒光強度較低。PB組細胞核內(nèi)的紅色熒光強度顯著增加，PB+酒精組細胞核內(nèi)的紅色熒光強度明顯減弱。
　　結(jié)論：
　　1.長期慢性飲酒導(dǎo)致膽紅素清除障礙，誘導(dǎo)UGT1A1表達，抑制肝腎膽紅素相關(guān)轉(zhuǎn)運體OATP1A1、肝MRP2表達，其中抑制作用可能與膽紅素調(diào)控因子CAR核內(nèi)轉(zhuǎn)位損傷有關(guān)。
　　2.CAR激活劑PB調(diào)控CAR進入細胞核，促進ALD小鼠膽紅素清除