基于組成型雄甾烷受體(CAR)降糖通路的中藥來源激動(dòng)劑及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目前，對(duì)于糖脂代謝紊亂治療還沒有良好的靶點(diǎn)。尋找有降血糖、降血脂雙重作用的治療靶點(diǎn)，能幫助開發(fā)療效好且副作用低的糖脂代謝紊亂治療藥物。已有研究報(bào)道組成型雄甾烷受體(CAR)能同時(shí)調(diào)節(jié)糖脂代謝，可能成為糖脂代謝紊亂繼發(fā)疾病新的有效治療靶點(diǎn)，是目前研究的熱點(diǎn)，但其機(jī)制尚不明確。一直以來，人們?cè)噲D從中藥及天然產(chǎn)物中尋找能同時(shí)降糖降脂的藥物。的確也發(fā)現(xiàn)了一些具有該作用的中藥或天然產(chǎn)物，如肉桂、黃連素、馬齒莧、千里光等。然而，大部分的研究往往只注

2、重于藥效研究層面，并沒有對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，這極大地限制了這些藥物的進(jìn)一步開發(fā)。因此，在中草藥中篩選能通過核受體CAR介導(dǎo)調(diào)節(jié)糖脂代謝的活性成分，并深入探究其相關(guān)機(jī)制具有重要意義。本文首先應(yīng)用基于hCAR3的CYP2B6報(bào)告基因體外篩選體系，篩選獲得能夠激活hCAR的中藥提取物和中藥活性成分吳茱萸次堿和吳茱萸堿。進(jìn)一步利用real-time RCR和染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）技術(shù)驗(yàn)證吳茱萸次堿和吳茱萸堿對(duì)hCAR都具有顯著的激活

3、作用。而后從這兩種生物堿與hCAR的相關(guān)性入手，探究其降糖降脂功效，并深入闡明其相關(guān)機(jī)制，為其深入開發(fā)提供理論依據(jù)。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、艌?bào)告基因模型篩選中草藥中hCAR的激動(dòng)劑。選取14種具降糖或降脂作用的中草藥進(jìn)行粗提取得到醇提物和水提物，MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定各提取物在HepG2細(xì)胞上的毒性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供合適的濃度選擇。采用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的hCAR3/hPXR介導(dǎo)的CYP2B6/CYP3A4報(bào)告基因模型，以hCAR和hPXR的經(jīng)

4、典激動(dòng)劑CITCO和利福平為陽性對(duì)照，初步篩選得到能夠激活hCAR或hPXR的中草藥提取物。其中大部分的提取物都能激活hPXR，且醇提物的激活效應(yīng)普遍大于水提物。僅衛(wèi)矛、羅布麻、木蝴蝶的醇提物和茵陳、柴胡的水提物對(duì)hCAR有較弱的激活作用。其次，利用hCAR3介導(dǎo)的CYP2B6報(bào)告基因模型考察了這5種中草藥的部分主要活性成分及其他中藥的活性成分對(duì)hCAR的激活作用。結(jié)果顯示，蘆丁、雷公藤堿、芹菜素、柴胡皂苷A、黃豆苷元、冬凌草素、巖白菜

5、素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿，這9種中藥活性成分可能對(duì)hCAR有潛在的激活效應(yīng)。為了更進(jìn)一步研究藥物濃度對(duì)激活效應(yīng)的影響，本文考察了不同濃度的中藥活性成分對(duì)hCAR的激活效應(yīng)。結(jié)果顯示這些中藥活性成分對(duì)hCAR的激活效應(yīng)呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。
　?、拼_證中藥活性成分對(duì)hCAR的激活作用。為確證中藥活性成分與hCAR激活的相關(guān)性，首先采用real-time PCR在LS174T細(xì)胞模型上檢測(cè)給藥后CYP2B6的mRNA水平變化。結(jié)果吳菜

6、萸堿和吳茱萸次堿對(duì)CYP2B6的基因誘導(dǎo)倍數(shù)顯著高于陽性對(duì)照CITCO及其他幾種中藥活性成分，表明具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，與報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果一致。并且課題組在HepG2細(xì)胞模型上進(jìn)行real-time PCR和western blotting實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示吳茱萸堿和吳茱萸次堿在mRNA和蛋白水平均能明顯誘導(dǎo)CYP2B6的表達(dá);且給予hCAR的經(jīng)典抑制劑能抑制其對(duì)CYP2B6的誘導(dǎo)。此外，在mCAR介導(dǎo)的報(bào)告基因模型中初步判斷吳茱萸次堿也是小

7、鼠CAR的激動(dòng)劑，而吳茱萸堿則不是。最后，利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，給予吳茱萸堿和吳茱萸次堿處理后，CAR與CYP2B6啟動(dòng)子區(qū)域特定位點(diǎn)的結(jié)合有明顯的增強(qiáng)，這說明了吳茱萸堿和吳茱萸次堿能激活hCAR從而上調(diào)CYP2B6的表達(dá)。
　?、菂擒镙谴螇A、吳茱萸堿降糖作用與hCAR相關(guān)性及其相關(guān)機(jī)制研究。已有文獻(xiàn)報(bào)道，吳茱萸次堿具有顯著的降血糖、血脂和胰島素的作用，但是相關(guān)機(jī)制研究卻鮮有報(bào)道。本課題主要從降糖方面進(jìn)行深入研究，探究吳茱萸次

8、堿和吳茱萸堿的降糖作用是否通過CAR介導(dǎo)，并探討相關(guān)機(jī)制。首先本文構(gòu)建了CAR調(diào)控糖代謝途徑中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-FOXO1、pcDNA3.1(+)-PGC1α、pcDNA3.1(+)-HNF4α，以及啟動(dòng)子區(qū)域含IRS和DR1位點(diǎn)的糖異生關(guān)鍵酶基因的報(bào)告質(zhì)粒pGL3-hPCK-Luc、pGL3-G6Pase-Luc。通過將報(bào)告基因質(zhì)粒和hCAR3、FOXO1、PGC1α、HNF4α的表達(dá)質(zhì)粒分別瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染He

9、pG2細(xì)胞，成功建立了hCAR3-FOXO1/hC AR3-PGC1α-HNF4α介導(dǎo)的PEPCK/G6Pase的報(bào)告基因模型，并進(jìn)行了驗(yàn)證。利用該報(bào)告基因模型探究了CAR與FOXO1、PGC1α和HNF4α對(duì)PEPCK/G6Pase啟動(dòng)子的影響，結(jié)果表明HepG2細(xì)胞經(jīng)吳茱萸次堿和吳茱萸堿處理后，在轉(zhuǎn)染FOXO1或PGC1α、HNF4α表達(dá)質(zhì)粒后能抑制PEPCK和G6Pase啟動(dòng)子活性，并且在共轉(zhuǎn)染hCAR3表達(dá)質(zhì)粒后，抑制作用更為顯

10、著?；蛩嚼胷eal-time PCR檢測(cè)了經(jīng)吳茱萸次堿和吳茱萸堿處理后PEPCK和G6Pase基因mRNA水平的表達(dá)顯著降低。采用染色質(zhì)免疫共沉淀法探究用吳茱萸次堿和吳榮萸堿處理轉(zhuǎn)染hCAR3表達(dá)質(zhì)粒后的HepG2細(xì)胞，HNF4α/FOXO1與PEPCK和G6Pase啟動(dòng)子DR1/IRS位點(diǎn)的結(jié)合情況。結(jié)果表明兩種生物堿給藥后，通過抑制HNF4α與PEPCK/G6Pase上DR1位點(diǎn)的結(jié)合，抑制FOXO1與PEPCK/G6Pase