特異性TRPM8激動(dòng)劑1-二仲丁基膦酰基戊烷(DAPA-2-5)對(duì)豚鼠感染后咳嗽作用的初步研究.pdf

1、研究背景：感染后咳嗽（PIC）是指呼吸道感染急性癥狀消失后，咳嗽仍然遷延不愈達(dá)3周以上而胸部X線檢查正常的亞急性咳嗽，個(gè)別患者持續(xù)時(shí)間甚至達(dá)數(shù)月或數(shù)年，臨床上癥狀主要表現(xiàn)為刺激性干咳或咳少量白色粘液痰，又稱為“感冒后咳嗽”。PIC是引起亞急性咳嗽最常見的病因，目前對(duì)該疾病仍然缺乏安全性較好的特異性治療。
　　本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，感染后咳嗽豚鼠模型以及患者均出現(xiàn)咳嗽反射敏感性增高的現(xiàn)象，而該現(xiàn)象與氣道TRPV1以及相關(guān)神經(jīng)肽的表達(dá)增

2、高相關(guān)，明確了病毒感染與PIC及咳嗽高敏感性的發(fā)病機(jī)制有重要的關(guān)系。但是，病毒感染以及相關(guān)TRP蛋白家族在PIC發(fā)生咳嗽高敏感性的機(jī)制中還有待更進(jìn)一步的研究來明確。薄荷醇是冷覺受體-瞬時(shí)電位受體通道M8（transient receptor potential melastatin8）的激動(dòng)劑，一直以來，由于其“清涼”化學(xué)特性被廣泛添加在OTC藥物中用于改善上呼吸道刺激的癥狀，也有研究發(fā)現(xiàn)薄荷醇可以降低豚鼠咳嗽模型和人類志愿者的咳嗽敏感

3、性。同時(shí)越來越多的研究報(bào)道指出TRPM8在呼吸道病毒感染以及各種呼吸道疾病的發(fā)生機(jī)制中有著重要的作用，因此，研究TRPM8在PIC發(fā)生咳嗽高敏感性發(fā)生機(jī)制中的作用，進(jìn)一步探索其作為新型鎮(zhèn)咳藥物靶點(diǎn)的可能性，將對(duì)PIC臨床治療具有相當(dāng)大的革新意義。
　　目的：探討TRPM8離子通道在感染后咳嗽發(fā)生機(jī)制中的作用，并進(jìn)一步探討其作為感染后咳嗽治療靶點(diǎn)的可能行。觀察不同濃度的新型TRPM8激動(dòng)劑（DAPA-2-5）對(duì)于感染后咳嗽發(fā)生咳嗽反

4、射敏感的影響。
　　方法：
　　1.感染后咳嗽模型制作：感染組豚鼠兩側(cè)鼻孔分別給予65ul事先擴(kuò)增好的RSV病毒溶液，正常對(duì)照組豚鼠給予等量 MEM培養(yǎng)基滴鼻處理，分別在第6、28、42和56天進(jìn)行檸檬酸激發(fā)試驗(yàn)。
　　2.藥物干預(yù)：干預(yù)組豚鼠于激發(fā)試驗(yàn)前10min給予不同濃度的TRPM8激動(dòng)劑Dapa-2-5(0.3mg/kg,0.75mg/kg,1.5mg/kg)口腔霧化，對(duì)照組以相同方法給予等容量的溶劑（生理鹽水

5、）后10分鐘檢測(cè)CRS以及咳嗽潛伏期。
　　3.咳嗽激發(fā)試驗(yàn)后12h處死動(dòng)物并取材，留肺組織形態(tài)學(xué)觀察以及RT-PCR法檢測(cè)RSV病毒復(fù)制量以及TRPM8的mRNA表達(dá)量。
　　4.研究各組豚鼠肺組織TRPM8表達(dá)相對(duì)量與各感染組的CRS相關(guān)性研究。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組（CCnt=9.3±0.633次/10min，C-Time=4.192±1.39min）相比，RSV感染后豚鼠 CRS在感染后急性期以及

6、亞急性期（1～4周）都顯著增高，其中CRS在第6天（急性期）開始增高并達(dá)到23.7±1.69次/10min(P<0.05)，同時(shí)咳嗽潛伏期（C-Time）顯著縮短至2.318±0.60分鐘(P<0.01)；CRS在第28天（亞急性期）達(dá)到高峰值（CCnt=27.1±1.96/10min,P<0.01），同時(shí)咳嗽潛伏期縮短至1.793±0.61分鐘(P<0.05)。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示感染后豚鼠肺組織RSV的mRNA含量

7、在感染后第6天（急性期）濃度最高，之后隨著感染時(shí)間推移呈現(xiàn)明顯的逐步降低趨勢(shì)，在感染后第56天達(dá)到最低值。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示感染后豚鼠肺組織TRPM8的mRNA相對(duì)含量在感染后第28天達(dá)到高峰值（4.38±0.079，p<0.01）并隨著感染時(shí)間的推移其表達(dá)呈下降趨勢(shì)，在感染后第56天達(dá)到最低值。
　　4.藥物干預(yù)對(duì)咳嗽頻率的作用：與空白對(duì)照組（Control+NS,14±4.876次/10min）相比，各藥物

8、組（Dapa-2-5不同劑量0.3mg/kg、0.75mg/kg以及1.5mg/kg）都能降低檸檬酸引起的咳嗽反射，分別為9.3±4.62次/10min（P<0.05）、8.9±2.846次/10min（P<0.05）以及7.3±3.093次/10min；與感染后第6天對(duì)照組（PID6+NS，22.1±7.062次/10min）對(duì)比，Dapa-2-50.75mg/kg組以及1.5mg/kg組都能降低急性期的CRS，分別為15.8±4.6

9、62次/10min(P<0.05)以及16.2±5.095(P<0.05)；與感染后第28天對(duì)照組（ PID28+NS,24.3±5.638次/10min）對(duì)比，Dapa-2-50.75mg/kg組以及1.5mg/kg組都能顯著地降低咳嗽頻率分別至17.7±5.658(P<0.05)以及15.5±3.779（P<0.001）。
　　5.藥物干預(yù)對(duì)咳嗽潛伏期的作用：與空白對(duì)照組（Control+NS,4.043±1.12 min）相

10、比，各藥物組（Dapa-2-5不同劑量0.3mg/kg、0.75mg/kg以及1.5mg/kg）都能延長咳嗽潛伏期，分別為4.530±1.241 min（P<0.05）、4.746±1.055 min（P<0.05）以及5.731±0.896min（P<0.05）；與各藥物對(duì)照組相比，高劑量組（1.5mg/kg）能有效延長PID6、PID42以及PID56的咳嗽潛伏期，分別為4.225±1.016 min,4.735±1.131 min

11、以及4.277±0.640min。
　　6.豚鼠肺組織TRPM8相對(duì)含量與感染期CRS相關(guān)性分析結(jié)果顯示：各感染組TRPM8表達(dá)量CRS增高有明顯的相關(guān)性，r值為0.5822。
　　結(jié)論：
　　1.感染組豚鼠均發(fā)生咳嗽反射敏感性明顯升高，28天組達(dá)到最高值，其CRS的升高并不依賴病毒的復(fù)制量，而肺組織病理學(xué)檢查支持急性期氣道炎癥改變，而肺實(shí)質(zhì)炎癥不明顯，表明豚鼠RSV急性感染和感染后咳嗽模型成功建立。
　　2.