UHPLC-MS-MS監(jiān)測(cè)甲氨蝶呤及其7-OH代謝物血藥濃度的臨床應(yīng)用.pdf

1、大劑量甲氨蝶呤（MTX）聯(lián)合亞葉酸鈣常用于治療惡性淋巴瘤、骨肉瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病等惡性腫瘤。甲氨蝶呤安全范圍窄，個(gè)體差異大，在抗腫瘤的同時(shí)對(duì)快速分裂的正常細(xì)胞也具有一定的細(xì)胞毒作用，故在發(fā)揮治療作用的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，采用大劑量甲氨蝶呤時(shí)進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，根據(jù)血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果調(diào)整用藥方案，以獲得最大的療效，降低不良反應(yīng)的發(fā)生。目前，臨床常用的監(jiān)測(cè)方法有熒光偏振免疫分析法和高效液相色譜法，但前者不能區(qū)分原藥及其代謝物，

2、儀器配套的試劑盒成本較高，易發(fā)生交叉反應(yīng)，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性；后者分析時(shí)間較長(zhǎng)，樣品前處理復(fù)雜，不能滿足臨床時(shí)效性的原則。本研究旨在建立一種快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的方法對(duì)采用大劑量甲氨蝶呤的患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，以指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥，確定安全治療窗，提高療效，降低不良反應(yīng)。
　　本研究運(yùn)用UHPLC-MS/MS技術(shù)，建立可同時(shí)檢測(cè)人血中甲氨蝶呤及其代謝物7-羥基甲氨蝶呤（7-OH-MTX）的方法，應(yīng)用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。以 D3-甲氨

3、蝶呤為內(nèi)標(biāo)，甲醇為沉淀劑采用蛋白沉淀法進(jìn)行樣本前處理；色譜柱為Agilent ZORBAX C18（2.1×100 mm，3.5μm），流速為0.3 mL/min，柱溫為35°C，流動(dòng)相為0.2％甲酸水溶液-甲醇進(jìn)行梯度洗脫；運(yùn)用Agilent6460型串聯(lián)質(zhì)譜，使用ESI離子源，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下進(jìn)行正離子檢測(cè)，檢測(cè)甲氨蝶呤m/z455.1→308.1，7-羥基甲氨蝶呤m/z471.0→324.1，D3-甲氨蝶呤m/z458

4、.2→311.1。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，甲氨蝶呤和7-羥基甲氨蝶呤在5~10000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r>0.99）；甲氨蝶呤和7-羥基甲氨蝶呤的日內(nèi)、日間精密度RSD（%）<15%；甲氨蝶呤和7-羥基甲氨蝶呤的提取回收率均>90%。結(jié)果表明，所建方法專屬性高、靈敏度高、前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確快速，可用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。采血管中添加劑的種類是影響血藥濃度檢測(cè)結(jié)果的重要因素之一，本研究考察促凝劑、EDTA-K2、EDTA-K3和肝素鋰4種

5、添加劑對(duì)甲氨蝶呤和7-羥基甲氨蝶呤測(cè)定結(jié)果的影響。以實(shí)驗(yàn)室人空白血漿配制的標(biāo)準(zhǔn)添加樣本為對(duì)照組，以促凝劑、EDTA-K2、EDTA-K3和肝素鋰4種不同采血管得到的上清液配制的標(biāo)準(zhǔn)添加樣本為檢驗(yàn)組，甲氨蝶呤的測(cè)定結(jié)果偏差分別在-8.52%~-11.05%、-1.78%~-5.71%、-2.73%~-13.20%和-2.92%~-5.74%之間，7-羥基甲氨蝶呤的測(cè)定結(jié)果偏差分別在0.34%~-3.29%、-38.17%~-55.46%、

6、-67.09%~-77.29%和-7.20%~-17.00%之間。結(jié)果表明，采血管中的添加劑對(duì)甲氨蝶呤的測(cè)定結(jié)果影響較?。?15%），添加劑 EDTA-K2和 EDTA-K3對(duì)7-OH-MTX的測(cè)定結(jié)果影響較大（>35%）。為確保臨床血樣測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇促凝劑真空采血管采集血樣。本研究收集惡性淋巴瘤患者44h、68h、92h和骨肉瘤患者2h、4h、6h、12h、24h、30h、44h、54h、63h、72h、87h的血液樣本，應(yīng)用

7、建立的UHPLC-MS/MS法進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，目前共收集11例淋巴瘤患者和4例骨肉瘤患者，88管血液樣本，29次治療藥物監(jiān)測(cè)。分析淋巴瘤患者的血藥濃度，甲氨蝶呤C44h>1μM占31.82%、C68h>0.1μM占38.09%；不同個(gè)體甲氨蝶呤C44h、C68h和C92h的濃度差分別為3.31μM、0.63μM和0.26μM，7-羥基甲氨蝶呤C44h、C68h和C92的濃度差分別為11.29μM、3.32μM和1.62μM；同一個(gè)體甲

8、氨蝶呤C44h和C68h的濃度差分別在0.02~2.76μM和0.29~0.58μM之間，7-羥基甲氨蝶呤C44h和C68h的濃度差分別在0.04~8.56μM、0.76~2.79μM之間；采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)分析，得回歸方程MTX C68h=0.172×MTX C44h-0.018（r=0.938，P=0.000），MTX C92h=0.

9、087×MTX C44h-0.030（r=0.904，P=0.035），MTX C92h=0.447×MTX C68h+0.003（r=0.961，P=0.009），7-OH-MTX C68h=0.245×7-OH-MTX C44h+0.031（r=0.626，P=0.004），7-OH-MTX C92h=0.290×7-OH-MTX C68h+0.056（r=0.959， P=0.041），7-OH-MTX C44h=2.565×MT

10、X C44h+1.976（r=0.764，P=0.000）；在MTX≤2.5 g/m2與MTX>2.5 g/m2組及CF≤30 mg與CF>30 mg組中MTX C44h、7-OH-MTX C44h、MTX C68h和7-OH-MTX C68h的P值均>0.05無顯著性差異；在MTX C44h≤1μM與MTX C44h>1μM組中MTX C68h和7-OH-MTX C44h的P值均<0.05有顯著性差異，7-OH-MTX C68h的P值

11、>0.05無顯著性差異；在MTX C68h≤0.1μM與MTX C68h>0.1μM組中7-OH-MTX C68h的P值>0.05無顯著性差異；在淋巴瘤患者黏膜炎發(fā)生率19.18%，腎毒性發(fā)生率9.09%，血液系統(tǒng)毒性發(fā)生率19.18%，肝毒性發(fā)生率9.09%。單獨(dú)分析2例骨肉瘤患者的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，MTX的體內(nèi)滯留時(shí)間分別為7.76 h、6.67 h，消除半衰期分別為0.114 h、0.109 h，體內(nèi)清除率分別為2.18、5.76 L/

12、h/m2；7-OH-MTX的體內(nèi)滯留時(shí)間分別為21.81 h、18.59 h，消除半衰期分別為15.44 h、10.03 h，體內(nèi)清除率分別為20.22、16.90 L/h/m2；骨肉瘤患者黏膜炎發(fā)生率25%，肝毒性發(fā)生率50%。結(jié)果表明，甲氨蝶呤及7-羥基甲氨蝶呤存在較大的個(gè)體差異；各采血點(diǎn)的血藥濃度存在一定的相關(guān)性；治療方案對(duì)血藥濃度的影響無統(tǒng)計(jì)意義；當(dāng)甲氨蝶呤C44h>1μM或C68h>0.1μM時(shí)，應(yīng)調(diào)整解救方案降低不良反應(yīng)；治