人Id3重組腺病毒的制備及對裸鼠致瘤作用影響的研究.pdf

1、分化抑制因子(inhibitorofdifferentiation,Id),又稱DNA結(jié)合抑制因子(inhibitorofDNAbinding),屬于螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix,HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,對堿性HLH(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子活性起負(fù)調(diào)控作用,主要功能是抑制細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞增殖。哺乳動物細(xì)胞含四種Id分子(Id1～I(xiàn)d4)。Id3作為血清誘導(dǎo)的立即早期基因首先在小鼠成纖維細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn),該分子參與多

2、種細(xì)胞生物學(xué)過程,包括淋巴細(xì)胞發(fā)育、骨骼肌分化、血管平滑肌增殖、胚胎的神經(jīng)形成和腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生等。
　　 人Id3基因cDNA編碼區(qū)基因全長360bp,編碼產(chǎn)物含有119個氨基酸殘基,分子量約13000。Id3在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其與腫瘤惡性程度的關(guān)系目前尚未得到一致性的結(jié)論。目前認(rèn)為,Id3基因表達(dá)調(diào)控途徑和機(jī)制的復(fù)雜性決定了其功能的多樣性,Id3蛋白對細(xì)胞周期的調(diào)控具有細(xì)胞種類和階段特異性。因此,探討作為細(xì)胞調(diào)控蛋白的I

3、d3分子在某些病理生理狀態(tài)下的生理、生物學(xué)功能具有重要意義。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn),Id3基因在人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中呈低表達(dá)水平,將外源性Id3基因?qū)階549細(xì)胞過表達(dá),可導(dǎo)致A549細(xì)胞生長抑制并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本課題構(gòu)建并純化了Id3重組腺病毒(Ad-Id3),觀察Ad-Id3對裸鼠移植瘤作用的影響。將Id3基因克隆到質(zhì)粒pUC18中構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18-Id3,pUC18-Id3經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切補(bǔ)平之后與

4、粘粒載體pAxCAwrit連接,構(gòu)建重組粘粒pAxCAwtit-Id3,使用包裝試劑盒包裝重組粘粒,轉(zhuǎn)染大腸桿菌,鑒定正確后大量制備重組pAxCAwtit-Id3,經(jīng)BspT1041酶切線性化后,用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞,體內(nèi)包裝成重組腺病毒Ad-Id3,采用反復(fù)“感染-收集-凍融”法獲取高滴度的重組腺病毒Ad-Id3,利用50％組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)計算重組腺病毒滴度,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和蛋白

5、質(zhì)印跡(Westernblot)法檢測細(xì)胞內(nèi)Id3基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,Id3基因成功克隆到腺病毒載體中,重組腺病毒滴度為1.8×1010pfu/mL,用RT-PCR檢測到Id3基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,Westernblot檢測到Id3蛋白在A549細(xì)胞中的高水平表達(dá)。
　　 為研究Id3轉(zhuǎn)基因過表達(dá)對A549細(xì)胞體內(nèi)致瘤作用的影響,將制備的Ad-Id3和空載體對照(Ad-LacZ)分別感染對數(shù)生長期的A549細(xì)胞,24h后將A5

6、49細(xì)胞、Ad-Id3感染的A549細(xì)胞和Ad-LacZ感染的A549細(xì)胞分別注入裸鼠皮下,建立裸鼠皮下肺腺癌移植瘤模型,比較該移植瘤與無Id3基因?qū)氲腁549細(xì)胞對照組移植瘤在小鼠體內(nèi)生長的差異。每周觀察一次小鼠皮下腫瘤生長情況,接種一個月后處死小鼠,摘除皮下腫瘤,游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小。采用RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測各組腫瘤組織中Id3mRNA和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),一個月后空白對照組和Ad-LacZ對照組移植瘤體積分別為1

7、42.18±54.52mm3和85.78±59.70mm3,Ad-Id3感染組移植瘤體積為2.22±0.70mm3,明顯小于空白對照組和Ad-LacZ對照組(P＜0.05),Ad-LacZ對照組與空白對照組相比沒有顯著差異;RT-PCR結(jié)果顯示Ad-Id3組腫瘤組織內(nèi)Id3mRNA條帶灰度值比值明顯高于空白對照組和Ad-LacZ對照組(P＜0.01);免疫組化結(jié)果顯示Ad-Id3組腫瘤組織內(nèi)Id3蛋白表達(dá)程度明顯高于空白對照組和Ad-L