人纖溶酶原K5重組腺病毒的構建及其功能研究.pdf

1、血管增生(neovascularization)與腫瘤的生長與轉移、血管增生性眼病、類風濕關節(jié)炎等重大疾病密切相關。目前治療血管增生性疾病著眼于血管增生平衡調空的兩個方面：要么應用血管增生抑制劑，要么采用血管增生刺激因子的拮抗劑，以恢復病理狀態(tài)下被打破的血管增生調空的平衡。近年來，人纖溶酶原(plasminogen)的水解片段kringle5因其獨特的性質引起了科學界的重視。 K5是人纖溶酶原中第五個環(huán)狀結構域，能特異性的抑制內

2、皮細胞生長，是最強的血管增生抑制因子之一。本實驗室在以前的研究中，利用原核表達體系獲得K5和K5突變體重組蛋白，并觀察它們對糖尿病性視網膜病和腫瘤的作用。研究顯示K5具有分子量小，性質穩(wěn)定，能有效的抑制血管內皮細胞的遷移以及增殖，對于糖尿病性視網膜血管增生和腫瘤的生長具有較強的抑制作用。 由于原核表達基因工程重組蛋白具有毒性無法去除，在體內易降解，需反復注射等無法克服的缺點，且不利于用于進行內源性：K5的作用機制的探討。因此，本

3、研究在原有的工作基礎上，希望通過基因治療的途徑來改善上述問題。鑒于缺陷性腺病毒載體具有安全、高效、簡單易行等優(yōu)點，我們選擇了Adeasy-1系統(tǒng)來作為K5基因治療的載體。Adeasy-1是缺陷性腺病毒的骨架質粒，通過其穿梭質粒Adtrack-CMV將外源性基因與病毒骨架整合，從而包裝出具有廣泛感染性的重組腺病毒。本研究構建攜帶．K5基因(含和不含真核信號肽)的重組腺病毒，鑒定腺病毒感染力和目的基因表達情況，并進行基本的細胞內功能研究，為

4、進一步研究攜帶K5的腺病毒體內抑制血管增生的效果和機制奠定基礎。 第一部分 K5病毒骨架的構建方法： 1．根據K5的序列設計特異性引物，將其重組進入pDisplay質粒用以獲取pDisplay質粒中的真核信號肽序列； 2．測序鑒定重組質粒； 3．根據K5的序列設計特異性引物，分別克隆出不帶信號肽的K5與攜帶信號肽的spK5基因片段(真核信號肽序列來源于pDisplay質粒)，將其重組進入腺病毒穿梭質粒構建

5、重組體； 4．測序鑒定重組質粒； 5．將穿梭質粒與Adeasy-1質粒Pme-I線性化后在大腸桿菌BJ5183中同源重組： 6．將上述同源重組質粒Pac-I線性化后獲得三種病毒骨架Ad-K5、Ad-spK5與Ad-control，純化滅菌； 7．酶切和PCR鑒定病毒骨架。 結果： 1．DNA序列分析顯示穿梭質粒構建正確； 2．酶切鑒定證明同源重組成功，PCR鑒定證明病毒骨架中攜帶有

6、目的基因。 第二部分重組腺病毒的包裝純化與功能實驗方法： 1．脂質體包裹法將上述三種純化滅菌的病毒骨架DNA導入293A細胞中，包裝病毒； 2．觀察GFP的表達情況； 3．8-10日左右凍融法裂解細胞，獲取原代病毒液； 4．用原代病毒液感染293細胞，大量擴增病毒； 5．CsCl梯度離心純化病毒液； 6．感染Hela細胞、肝細胞，內皮細胞等觀察病毒感染能力； 7．Weste

7、rn-blot檢測病毒攜帶的K5基因表達情況； 8．MTT法檢測重組病毒對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響。 結果： 1．綠色熒光蛋白(GFP)表達顯示病毒包裝良好； 2．純化后病毒具有很高的感染細胞的能力； 3．western-blot結果顯示攜帶K5基因的腺病毒可在宿主細胞中表達K5和spK5蛋白。 4．MTT結果顯示含與不含信號肽的K5重組腺病毒均有抑制血管增生的作用。 結論

8、 1．成功構建了Ad-K5、Ad-spK5以及Ad-control三個重組腺病毒骨架質粒； 2．成功包裝出了rAd-K5、rAd-spK5以及rAd-control三個重組腺病毒； 3．純化后的三種病毒對人正常肝細胞、Hela細胞、人臍靜脈內皮細胞等多種細胞中都具有很高的感染力； 4．重組腺病毒在細胞中成功表達出目的蛋白，顯示重組腺病毒具有表達目的蛋白的活性； 5．MTT結果顯示含與不含真核信號肽的重組