人纖溶酶原K5抑制肝癌血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的作用及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文人纖溶酶原K5抑制肝癌血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的作用及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)姓名：楊霞申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：高國(guó)全朱振宇20060501中文摘要K5的實(shí)驗(yàn)研究主要集中在血管增生性眼病動(dòng)物模型上，而有關(guān)K5在腫瘤治療方面的研究卻少有報(bào)道：(2)K5完整多肽已獲美國(guó)專利和中國(guó)專利保護(hù)，無自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)；(3)相對(duì)于K5功能和潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的研究，其抑制血管增生的活性和Kringle結(jié)構(gòu)域中二硫鍵的位置、數(shù)量所

2、決定的內(nèi)外環(huán)結(jié)構(gòu)的關(guān)系尚不明確。因此，本研究擬從以下三方面解決上述問題：(1)運(yùn)用基因工程方法獲得人纖溶酶原K5純化蛋白，在新生血管豐富的肝癌細(xì)胞同種種植小鼠和異種種植裸鼠模型上觀察K5抑制肝癌血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)并初步探討其作用的分子機(jī)制；(2)對(duì)K5基因進(jìn)行改造，獲得比K5分子量更小、性質(zhì)更穩(wěn)定的K5突變體I(K5mutantl，K5mutl)基因工程純化蛋白。觀察其抑制肝癌血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的作用及其效果；(3)根據(jù)K5蛋白的

3、結(jié)構(gòu)特征和二硫鍵分布特點(diǎn)，構(gòu)建并表達(dá)K5的兩個(gè)缺失突變體蛋白。在體外細(xì)胞模型和體內(nèi)肝癌皮下種植瘤模型上分析其抗血管增生活性，從而判斷維持K5生物活性所需的最小氨基酸序列和基本空間結(jié)構(gòu)，明確K5kringle結(jié)構(gòu)域和二硫鍵與其功能的關(guān)系。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：第1部分K5缺失突變體I、Ⅲ的構(gòu)建及表達(dá)純化L成功構(gòu)建K5缺失突變體I、Ⅲ。通過PCR獲得的目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符做理論計(jì)算K5為292bp，K5mu

4、tl為258bp，K5mut3為180bp)。測(cè)序結(jié)果表明目的基因片段與pET22b()連接無誤，閱讀框架正確，K5突變體構(gòu)建成功。2獲得高純度可溶性的突變體蛋白。鑒定正確的重組體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌中，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)，可表達(dá)出可溶性重組蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌經(jīng)溶菌酶充分消化后，離心取上清，用Ni2HisBindResin親和柱純化，獲得高純度可溶性蛋白。用凝膠成像系統(tǒng)(GENEGENIUS公司產(chǎn)品)對(duì)凝膠進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果