桿狀病毒介導的DNMTlsiRNA對人胰腺癌裸鼠移植瘤抑制作用的實驗研究.pdf

1、目的:觀察介導RNA干擾(RNAi)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)基因表達的桿狀病毒載體(Bac-si-DNMT1-D)作用人胰腺癌裸鼠移植瘤組織后胰腺癌細胞生長和凋亡的情況及對裸鼠的毒副作用；檢測腫瘤細胞中DNMT1基因的表達和抑癌基因啟動子區(qū)域甲基化的變化；初步探索運用桿狀病毒介導的DNMT1siRNA治療胰腺癌的可行性及其分子機制。
　　 方法:1.建立人胰腺癌SW1990細胞裸鼠移植瘤模型,選取24只,隨機分為4組:生

2、理鹽水組、空載體組、低濃度病毒組及高濃度病毒組。隔天向瘤內(nèi)注射重組病毒或生理鹽水0.1ml,共8次,與此同時測量各組腫瘤體積變化。實驗進行25天后處死裸鼠,采集移植瘤標本,并測量移植瘤重量及體積,繪制移植瘤生長曲線。2.裸鼠處死后收集裸鼠血清,檢測血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)的含量。3.在無菌操作下采集裸鼠的心、肝、腎及移植瘤標本,使用HE染色法觀察各組間標本的病理變化。4.脫氧

3、核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)法檢測桿狀病毒載體作用后各組裸鼠移植瘤細胞凋亡情況。5.實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timePCR)檢測各組裸鼠移植瘤細胞中DNMT1mRNA的表達情況。6.免疫印跡法(Westernblot)檢測各組裸鼠移植瘤細胞中DNMT1、B細胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白X(Bax)和B細胞淋巴瘤/白血病基因02(Bcl-2)的蛋白表達情況。7.甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測各組裸鼠移

4、植瘤細胞中RAR-b、p16、GST-p、hMLH1基因啟動子區(qū)甲基化情況。8.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測各組裸鼠移植瘤細胞中RAR-bmRNA表達情況。
　　 結(jié)果:1.兩病毒組腫瘤生長較對照組明顯被抑制；瘤重:空載體組(1.00±0.29)g、生理鹽水組(0.96±0.18)g、低濃度病毒組(0.54±0.35)g和高濃度病毒組(0.49+0.36)g。兩病毒組腫瘤瘤重小于兩對照組(P＜0.05)。2.各組荷瘤裸鼠的血

5、清檢測發(fā)現(xiàn)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)的含量的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。3.光鏡下確認所取組織為惡性腫瘤組織；鏡下心、肝及腎組織結(jié)構(gòu)正常,未見有炎癥、變性、壞死、細胞凋亡及轉(zhuǎn)移性癌細胞等。4.空載體組、生理鹽水組、低濃度病毒組和高濃度病毒組的凋亡指數(shù)分別為(16.4±8.5)%、(22.8±6.7)%、(49.3±4.6)%和(52.4±5.2)%,兩病毒組的凋亡率明顯高于空

6、載體組和生理鹽水組(P＜0.01),但兩病毒組間無明顯差異(P＞0.05)。5.實時熒光定量PCR示低濃度病毒組和高濃度病毒組腫瘤組織中DNMT1mRNA的表達量為(0.22±0.07)和(0.09±0.05),顯著低于生理鹽水組的(1.01±0.18)和空載體組(0.96±0.35,P＜0.01)。6.Westernblot結(jié)果示兩病毒組腫瘤組織中DNMT1及Bcl-2蛋白表達低于兩對照組,但Bax高于兩對照組(P＜0.05)。7.M

7、SP結(jié)果顯示DNMT1siRNA桿狀病毒干擾胰腺癌移植瘤后腫瘤細胞中RAR-b基因啟動子區(qū)發(fā)生去甲基化改變。8.RT-PCR結(jié)果與MSP檢測結(jié)果相對應(yīng),RNA干擾后腫瘤細胞內(nèi)RAR-b基因重新表達。
　　 結(jié)論:1.桿狀病毒介導的DNMT1siRNA載體在體內(nèi)可以有效抑制DNMT1基因的表達。2.桿狀病毒介導的DNMT1siRNA載體能促使胰腺癌細胞發(fā)生凋亡及生長抑制,其機制可能與腫瘤細胞中RAR-b基因啟動子區(qū)發(fā)生去甲基化改變