MAGE-A3多肽瘤苗對(duì)人乳腺癌細(xì)胞及裸鼠移植瘤免疫作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。與人體許多其它惡性腫瘤一樣，乳腺癌也是來自自身細(xì)胞的突變，因此抗原性較弱，并且腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生各種封閉因子使其逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)控系統(tǒng)，同時(shí)患者的自身免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)抑制性優(yōu)勢(shì)和癌組織局部的免疫功能低下，使機(jī)體的免疫機(jī)制已不能有效控制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而針對(duì)乳腺癌的常規(guī)治療方法如放療、化療等對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)有明顯的抑制作用。因此，如何調(diào)動(dòng)患者機(jī)體自身的防御機(jī)制，改善免疫功能狀態(tài)，探索新的針對(duì)乳腺癌的免疫治療方法

2、，一直是科學(xué)家們努力研究的焦點(diǎn)。近年來，樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)疫苗作為一種新的抗腫瘤免疫治療手段向人們展示了誘人的前景；但由于外周血中DC的數(shù)量?jī)H占白細(xì)胞總數(shù)的0.1％，且患者的腫瘤細(xì)胞常常分泌一些細(xì)胞因子而抑制了DC的功能，因此通過體外培養(yǎng)的方式擴(kuò)增DC，然后回輸體內(nèi)激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)，具有重要的實(shí)用價(jià)值和理論意義。設(shè)計(jì)腫瘤治療性疫苗的關(guān)鍵是尋找到腫瘤的特異性靶抗原并將其輸送給機(jī)體的免疫系統(tǒng)，隨后被免疫

3、系統(tǒng)視為異物而被識(shí)別，最后激活的免疫系統(tǒng)通過一系列的作用機(jī)制將帶有腫瘤抗原的癌細(xì)胞摧毀。抗原蛋白或多肽在DC內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于抗原的提呈及特異性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)具有非常重要的作用，因此利用一些載體將腫瘤的抗原成分轉(zhuǎn)染至DC制備瘤苗，已成為腫瘤生物治療領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點(diǎn)之一。由于病毒性載體存在自身免疫性反應(yīng)和安全性問題，如外源性病毒DNA注入體內(nèi)后，可能整合到宿主基因組上，使宿主細(xì)胞的抑癌基因失活或癌基因活化從而轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞，因此限制了其在臨床中

4、的廣泛應(yīng)用；作為非病毒性載體系統(tǒng)的脂質(zhì)體類物質(zhì)在體內(nèi)可自然降解、無免疫原性、可重復(fù)使用、無明顯的毒副作用等特點(diǎn)，在目前的抗腫瘤疫苗中具有獨(dú)特的作用。黑色素瘤抗原基因(Melalaoma associated antigerl gerle-A3，Mage-A3)編碼的抗原為HLA限制性的腫瘤排斥性抗原，在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)，在除睪丸和胎盤以外的其他正常組織中均不表達(dá)，由于睪丸和胎盤組織中缺乏HLA-Ⅰ類分子的表達(dá)，使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞

5、(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)無法發(fā)揮殺傷作用，同時(shí)睪丸和胎盤組織中的滋養(yǎng)細(xì)胞間連接十分緊密并表達(dá)CD95配體，從而形成了一個(gè)物理性和功能性的屏障，可阻止CTL的進(jìn)入并可引起進(jìn)入的T細(xì)胞發(fā)生凋亡，顯示了作為腫瘤治療性疫苗靶抗原的潛在價(jià)值。為此我們首先利用RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction，逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng))和SSP-PCR(seque

6、nce special primer polymerase chain reaction，序列特異性引物-多聚酶鏈反應(yīng))的方法，分別觀察了人乳腺癌MCF-7、卵巢癌SK-OV3及正常血管內(nèi)皮EC-304等細(xì)胞株中MAGE-A3基因及人類白細(xì)胞抗原HLA-A2等位基因的表達(dá)情況；結(jié)果顯示：乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中MAGE-A3及HLA-A2基因均為陽(yáng)性表達(dá)，卵巢癌細(xì)胞株SK-OV3中Mage-A3基因呈陽(yáng)性表達(dá)而HLA-A2則為陰性表達(dá)，

7、正常血管內(nèi)皮細(xì)胞株EC-304中MAGE-A3為陰性表達(dá)而HLA-A2則為陽(yáng)性表達(dá)。隨后從HLA-A2表達(dá)陽(yáng)性的健康志愿者外周血中分離獲得單核細(xì)胞，在含有GM-CSF、IL-4和a-TNF等細(xì)胞因子的1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)下繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD1a、HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表達(dá)率分別由第1天的2.3％、46.2％、18.4％、8.36％、19.8％逐漸升至第3天的14.3％、57.8％、42.7％、9.2％、

8、47.8％及第6天的21.8％、99.0％、63.4％、18.9％、80.6％；其中代表DC成熟程度的CD83及HLA-Ⅱ類分子的表達(dá)均有明顯的增加。高倍相差顯微鏡及電鏡觀察可見形態(tài)特異的DC細(xì)胞，DC的得率從第1天的2.12％升至第3天的9.89％及第6天的16.31％，DC的純度從第1天的2.08％升至第3天的61.25％及第6天的90.83％，證實(shí)可以從外周血單核細(xì)胞中培養(yǎng)擴(kuò)增出大量較高純度的DC細(xì)胞。本文探討了MAGE-A3多肽