牦牛小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1的克隆及表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、牦牛是青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的特有畜種，其體貌特征、生理特點(diǎn)、牧食習(xí)性均有別于其它低海拔牛種。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，牦牛具有區(qū)別于其它低海拔牛種的適應(yīng)高寒營(yíng)養(yǎng)脅迫的獨(dú)特氮循環(huán)代謝機(jī)制，其中應(yīng)包括小肽吸收機(jī)制。小肽作為蛋白降解和參與合成蛋白的含氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其在胃腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收主要通過(guò)PepT1的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)完成。目前圍繞低海拔動(dòng)物雞、豬、綿羊、黃牛PepT1分子基礎(chǔ)及調(diào)控機(jī)理已有相關(guān)報(bào)道，但針對(duì)高原反芻動(dòng)物小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1的相關(guān)研究尚屬空白。因此，

2、本論文通過(guò)對(duì)牦牛PepT1基因的克隆、組織表達(dá)分布特征，以及活性調(diào)控的研究，旨在初步揭示牦牛吸收轉(zhuǎn)運(yùn)小肽的分子基礎(chǔ)及調(diào)控機(jī)理。相關(guān)研究的深入開(kāi)展，不僅可以豐富高原反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)理論及研究手段，進(jìn)而完善牦牛補(bǔ)飼策略，減少因日糧養(yǎng)分供給不平衡而造成的環(huán)境污染，具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的生態(tài)效益。研究?jī)?nèi)容包括：1）牦牛小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1的克隆及生物學(xué)分析；2）牦牛PepT1組織表達(dá)分布特性及比較研究牦牛與本地黃牛PepT1mRNA表達(dá)對(duì)日糧氮水平的響

3、應(yīng)；3）比較研究牦牛與本地黃牛PepT1mRNA表達(dá)在CHO-k1細(xì)胞中對(duì)底物小肽的響應(yīng)特征。主要研究結(jié)果如下：
　　1）通過(guò)RT-PCR和RACE末端快速擴(kuò)增法克隆得到：牦牛小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1（yPepT1；Genbank：KT725253）全長(zhǎng)包含2805bp，編碼707個(gè)氨基酸，其中含有5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、2個(gè)PKA位點(diǎn)、3個(gè)PKC位點(diǎn)；預(yù)測(cè)該序列存在12個(gè)跨膜區(qū)，等電點(diǎn)（pI）為7.1，蛋白分子量為78.4kDa；無(wú)信

4、號(hào)肽，為非分泌性蛋白。牦牛PepT1序列中Val（9.1％）含量最高，最低的為T(mén)rp（1.3%）；非極性（疏水）AA占47.81%，極性（親水性）AA占52.19%，為親水性氨基酸；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)yPepT1編碼的AA含有α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲。系統(tǒng)進(jìn)化分析亦發(fā)現(xiàn)牦牛與黃牛親緣關(guān)系最近；同源性比對(duì)yPepT1與黃牛、綿羊、野豬、藏豬、人類、小鼠和家兔PepT1的同源性分別為：99%、95%、86%、85%、83%、81%和79%，其中

5、yPepT1與黃牛PepT1的AA序列在第258、515、536、544個(gè)AA處存在差異。
　　2）放牧牦牛PepT1mRNA在胃腸道各組織、腎臟和乳腺組織中均有表達(dá)，其中，空腸表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織（P<0.001），回腸和十二指腸次之，網(wǎng)胃和乳腺相對(duì)較低；其他組織相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為瘤胃、瓣胃、結(jié)腸、皺胃、盲腸、肝臟及腎臟，其中皺胃、盲腸、肝臟及腎臟表達(dá)水平極低。
　　3）牦牛和本地黃牛飼養(yǎng)和屠宰對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

6、表明：PepT1mRNA在各組織中的表達(dá)量受基因型，日糧氮水平及二者交互影響。牦牛與本地黃牛PepT1mRNA相對(duì)表達(dá)量在瘤胃、瓣胃、十二指腸、空腸、回腸和肝臟組織存在基因型差異（P<0.05）；在瘤胃、網(wǎng)胃、十二指腸、回腸組織中存在氮水平差異（P<0.05）；隨著日糧氮水平的增加，兩基因型牛PepT1mRNA在瘤胃、瓣胃和回腸組織中線性增加（P<0.05），而在十二指腸和肝臟組織中呈線性下降（P<0.05）。在低氮（10.32g N/

7、kg DM）水平下，本地黃牛PepT1mRNA相對(duì)表達(dá)量在瓣胃、十二指腸、回腸和肝臟顯著高于牦牛，而在空腸，牦牛顯著高于本地黃牛（P<0.05）；在中低氮水平（19.49gN/kg DM）條件下，本地黃牛PepT1mRNA相對(duì)表達(dá)量在瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、空腸和肝臟顯著高于牦牛，而在回腸牦牛顯著高于本地黃牛（P<0.05）；在中高氮（28.50g N/kg DM）水平條件下，本地黃牛PepT1mRNA相對(duì)表達(dá)量在瘤胃、瓣胃、十二指腸、回腸和

8、肝臟顯著高于牦牛，而在網(wǎng)胃牦牛顯著高于本地黃牛（P<0.05）；在高氮水平條件下（37.6g N/kg DM），本地黃牛PepT1mRNA相對(duì)表達(dá)量在十二指腸和回腸顯著高于牦牛，而在空腸牦牛顯著高于本地黃牛（P<0.05）。這表明牦牛存在有別于黃牛的小肽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，且牦牛更能適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)脅迫條件以適應(yīng)其極端的生存環(huán)境。
　　4）借助分子生物學(xué)方法成功構(gòu)建牦牛和本地黃牛真核質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-yPepT1和pcDNA3.1-

9、bPepT1，并建立pcDNA3.1-yPepT1和pcDNA3.1-bPepT1質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞（CHO-k1）的外源表達(dá)模型。通過(guò)yPepT1和bPepT1在CHO-k1細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，檢測(cè)重組蛋白yPepT1和bPepT1對(duì)底物小肽的響應(yīng)。結(jié)果表明：PepT1mRNA相對(duì)表達(dá)量存在基因型、小肽處理及兩者交互的影響。添加小肽組PepT1mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均有不同程度的增加，其中，牦牛PepT1mRNA相對(duì)表達(dá)

10、量在Met-Lys、Lys-Met、Let-Lys、Thr-Ser-Lys、Lys-Try-Lys、Met-Gly-Met-Met組顯著高于CKy組（P<0.05），而Met-Met、Leu-Ser-Phe、Lys-Thr-Ser與CKy組無(wú)顯著差異（P>0.05）；本地黃牛PepT1mRNA相對(duì)表達(dá)量在Met-Met、Met-Lys、Lys-Met、Lys-Lys、Leu-Ser-Phe、Lys-Thr-Ser、Thr-Ser-Lys

11、組顯著高于CKb組（P<0.05），而在Lys-Try-Lys和Met-Gly-Met-Met組與CKb組無(wú)顯著差異（P>0.05）。此外，二肽處理組中，Met-Lys和Lys-Lys組PepT1mRNA相對(duì)表達(dá)量本地黃牛顯著高于牦牛（P<0.05）；三肽處理組中，Leu-Ser-Phe和Lys-Thr-Ser組PepT1mRNA相對(duì)表達(dá)量本地黃牛顯著高于牦牛（P<0.05），而Lys-Lys組牦牛顯著高于本地黃牛（P<0.05）。