肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中長(zhǎng)鏈非編碼RNA和miRNA差異表達(dá)譜及相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類的健康。肌層浸潤(rùn)性膀胱癌復(fù)發(fā)率及死亡率均較非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌顯著增高，是膀胱癌研究中的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是指一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，其自身不編碼蛋白。最初lncRNA被認(rèn)為在基因組轉(zhuǎn)錄中不起作用，近年來(lái)，這些過(guò)去被認(rèn)為是“垃圾序列”的lncRNA越來(lái)越引起學(xué)者的重視，其具有重要的生物學(xué)功能。研究表明，對(duì)于某些特定的ln

2、cRNA，其在正常組織和腫瘤組織中表達(dá)水平有明顯差異，而且有些差異和腫瘤的分期及預(yù)后也密切相關(guān)。目前，lncRNA相關(guān)研究已成為腫瘤分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)，就泌尿系腫瘤來(lái)講，前列腺癌相關(guān)lncRNA研究開(kāi)始較早，相關(guān)熱點(diǎn)lncRNA包括前列腺癌基因表達(dá)標(biāo)志物1(PCGEM1)、前列腺特異性抗原3(DD3/PCA3)、前列腺癌非編碼RNA1(PRNCR1)等。膀胱癌方面的相關(guān)lncRNA研究尚處于研究進(jìn)展期。
　　lncRNA和miRN

3、A的相互作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要調(diào)節(jié)作用。2011年，競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)假說(shuō)在此基礎(chǔ)上被提出，并被越來(lái)越多的研究試驗(yàn)所證實(shí)。ceRNA并非是一種新發(fā)現(xiàn)的RNA，而是一種RNA相互作用的調(diào)節(jié)機(jī)制，這一機(jī)制認(rèn)為lncRNA、miRNA、mRNA及其它RNAs之間是功能互相調(diào)控的，這些RNA之間正常時(shí)處于一種平衡穩(wěn)態(tài)，一旦其中某一個(gè)或幾個(gè)RNA表達(dá)出現(xiàn)異常上調(diào)或下調(diào)，它們之

4、間的這種平衡穩(wěn)態(tài)就會(huì)失衡破壞，就會(huì)導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生。lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)作為一種新的假說(shuō)，越來(lái)越被研究重視，并已在胃癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌中得以構(gòu)建。目前仍缺乏在全基因組范圍內(nèi)，特別是基于高通量檢測(cè)與大規(guī)模樣本量的肌層浸潤(rùn)性膀胱癌相關(guān)的lncRNA和miRNA及的ceRNA的綜合分析。
　　癌癥基因圖譜計(jì)劃(The Cancer Genome Atlas，TCGA)項(xiàng)目組最初由美國(guó)國(guó)家腫瘤研究所(

5、NCI)和美國(guó)國(guó)家人類基因組研究所(NHGRI)組成，目前其中已經(jīng)收集了超過(guò)30種人類癌癥種類，共約10000例患者樣本和臨床病理信息，并且數(shù)據(jù)全部免費(fèi)開(kāi)放，TCGA的最終目標(biāo)為所有的癌癥基因組構(gòu)建一套相關(guān)的完整“圖譜”。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，免費(fèi)數(shù)據(jù)不僅包括全而詳實(shí)的臨床病例資料，還包括患者分子水平測(cè)序結(jié)果。目前，已經(jīng)有超過(guò)5萬(wàn)個(gè)lncRNA基因在人類基因組中被克隆和鑒定，但僅有其中極少一部分的生物學(xué)功能得到相關(guān)驗(yàn)證。如何尋找特定腫瘤的

6、功能性lncRNA是相當(dāng)困難的。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)相當(dāng)于腫瘤臨床及分子信息的一個(gè)蘊(yùn)藏豐富的寶庫(kù)，如何從這一寶庫(kù)中甄選出我們希望挖掘的寶藏，就需要嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的工具。這就需要借助生物信息學(xué)工具，及相關(guān)測(cè)序統(tǒng)計(jì)工具，我們可以從大數(shù)據(jù)中摒棄無(wú)關(guān)信息，發(fā)現(xiàn)潛在研究位點(diǎn)。
　　研究方法：
　　生物信息學(xué)是計(jì)算機(jī)科學(xué)、數(shù)學(xué)和生物學(xué)界面的一門多學(xué)科的交叉學(xué)科。它依賴計(jì)算機(jī)科學(xué)、工程和應(yīng)用數(shù)學(xué)的基礎(chǔ)，依賴實(shí)驗(yàn)和衍生數(shù)據(jù)的大量貯存。在本研究中，借助生

7、物信息學(xué)分析技術(shù)，通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)提取共341個(gè)樣本的3級(jí)RNAseq和miRNASeq數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分為2個(gè)隊(duì)列:322例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和19例正常樣本。腫瘤樣本與正常樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后，所有未表達(dá)的RNA數(shù)據(jù)和miRNA數(shù)據(jù)被濾除。所得數(shù)據(jù)通過(guò)DESeq軟件進(jìn)行處理，得到肌層浸潤(rùn)性膀胱癌差異表達(dá)RNA(differentially expressed RNA，DERNA)和差異表達(dá)miRNA(differentially exp

8、ressed miRNA，DEmiRNA)，進(jìn)而借助GENCODE lncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（第22版）從中確認(rèn)差異表達(dá)lncRNA。得到肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的DElncRNA和DEmiRNA后，借助miRcode數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)lncRNA-miRNA的相互作用，借助miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索miRNA靶向的mRNAs，進(jìn)而成功構(gòu)建其lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)。
　　為進(jìn)一步論證TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析得出的肌層浸潤(rùn)性膀

9、胱癌中長(zhǎng)鏈非編碼RNA差異表達(dá)譜的科學(xué)性，我們篩選研究中預(yù)測(cè)的3個(gè)表達(dá)上調(diào)lncRNA(LINC00162、AATBC、UCA1)和4個(gè)表達(dá)下調(diào)lncRNA(MIR100HG、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1)做進(jìn)一步的初步試驗(yàn)驗(yàn)證。通過(guò)Real-Time PCR檢測(cè)32對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和癌旁正常組織標(biāo)本中上述7個(gè)差異表達(dá)lncRNA，并進(jìn)一步選取目前尚未在膀胱癌中報(bào)道的長(zhǎng)鏈非編嗎RNA HAND2-A

10、S1做進(jìn)一步初步功能驗(yàn)證。通過(guò)Real-Time PCR檢測(cè)HAND2-AS1在SV-HUC-1和膀胱癌細(xì)胞株5637，RT4和J82的表達(dá)情況，進(jìn)一步通過(guò)MTT計(jì)數(shù)法和劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell，我們驗(yàn)證了HAND2-AS1對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中l(wèi)ncRNA和miRNA差異表達(dá)譜及相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析研究
　　1.1.肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的差異表達(dá)R

11、NA(differentially expressed RNAs，DERNAs)
　　研究將322個(gè)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌腫瘤組織（隊(duì)列T）和19個(gè)正常組織(隊(duì)列N)中的RNA的表達(dá)水平進(jìn)行研究。差異表達(dá)基因定義為差異倍數(shù)(log2)絕對(duì)值大于1且校正P值小于0.01的基因。通過(guò)此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理，結(jié)果共有472(34.08％)個(gè)表達(dá)上調(diào)和913(65.92％)個(gè)表達(dá)下調(diào)的RNA被確認(rèn)（見(jiàn)附表1）。同時(shí)，為了更好地解釋肌層浸潤(rùn)性膀胱癌

12、發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，這些差異表達(dá)DERNA的功能特性被通過(guò)KOBAS2.0進(jìn)行KEGG分析。27個(gè)DERNA（包括21個(gè)表達(dá)上調(diào)者和6個(gè)表達(dá)下調(diào)者）被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞周期。
　　1.2.肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的差異表達(dá)lncRNA(differentially expressed lncRNAs，DElnRNAs)
　　根據(jù)差異倍數(shù)(log2)絕對(duì)值＞1.5和校正P值＜0.01這一判定標(biāo)準(zhǔn)，在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中，我們發(fā)現(xiàn)有4個(gè)lncRN

13、A（LINC00162、AATBC、UCA1和EPR1）的表達(dá)顯著上調(diào)，有7個(gè)lncRNA(MIR2HG、MIR100HG、BRE-AS1、M1R143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1和PGM5-AS1，)被證明表達(dá)下調(diào)。根據(jù)腫瘤組織樣本病理TNM分期，將樣本分為T3+T4對(duì)比T1+T2， N2+N3對(duì)比N0+N1，M1對(duì)比M0以及有淋巴脈管浸潤(rùn)對(duì)比無(wú)淋巴脈管浸潤(rùn)這些亞組，進(jìn)而對(duì)樣本的lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行相關(guān)的比較

14、分析，我們確定了8個(gè)表達(dá)上調(diào)lncRNA(LINC00221、UCA1、ZFHX4-AS1、LINC00284、LOC283731、LINC00698、CNTFR-AS1和LOC284379)和4個(gè)表達(dá)下調(diào)lncRNA（LINC00390、SSTR5-AS1、HECTD2-AS1和LOC400696）和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的疾病進(jìn)展分期密切相關(guān)。
　　1.3.肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的差異表達(dá)miRNA(differentially exp

15、ressed miRNAs，DEmiRNAs)
　　為了構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)，我們還比較了腫瘤組織和正常組織中的miRNA表達(dá)譜。確定了11個(gè)差異表達(dá)miRNA，包括2個(gè)表達(dá)上調(diào)和9個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA。利用Kaplan-Meier曲線分析法研究肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者DEmiRNA相關(guān)的總生存率，這11個(gè)DEmiRNA中有5個(gè)（包括let-7c、mir-100、mir-143、mir-1-2和m

16、ir-145）被證明與患者生存率相關(guān)。
　　1.4.肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的相關(guān)eeRNA調(diào)控網(wǎng)的構(gòu)建
　　我們基于以上數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個(gè)lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)。分析得出有32個(gè)DERNA參與了ceRNA調(diào)控網(wǎng)，這32個(gè)DERNA中，部分已被報(bào)道為癌癥相關(guān)基因，如CDC25A、 CDKN1A、 MMP1、 MMP13和SOX4。同時(shí)，我們對(duì)調(diào)控網(wǎng)中所包含的DElncRNA和DERNA的表達(dá)水平進(jìn)行了回歸

17、分析，結(jié)果顯示了參與ceRNA的lncRNA和mRNA表達(dá)水平之間具有非常一致甚至近乎完美的相互作用關(guān)系。我們還分析了參與ceRNA調(diào)控網(wǎng)的32個(gè)DERNA，分析了由DElncRNA間接調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)通路，證實(shí)有10條KEGG通路中上述DERNA顯著富集，其中包括4條腫瘤相關(guān)通路:腫瘤MicroRNAs、膀胱癌、細(xì)胞周期和慢性粒細(xì)胞白血病”。
　　2.肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中l(wèi)ncRNA差異表達(dá)譜的初步驗(yàn)證及HAND2-AS1初步功能研

18、究
　　2.1.膀胱癌中相關(guān)差異表達(dá)lncRNA的real-time PCR檢測(cè)結(jié)果
　　我們從相關(guān)lncRNA差異表達(dá)譜中選取了3個(gè)預(yù)測(cè)表達(dá)上調(diào)和4個(gè)預(yù)測(cè)表達(dá)下調(diào)的lncRNA進(jìn)行初步驗(yàn)證。定量Real-Time PCR檢測(cè)了共計(jì)32對(duì)膀胱癌腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本中7個(gè)lncRNA的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明:前期研究預(yù)測(cè)上調(diào)的lncRNA包括AATBC與UCA1，試驗(yàn)結(jié)果與前期預(yù)測(cè)結(jié)果相符。前期研究預(yù)測(cè)下調(diào)的lncRNA包括

19、MIR100HG、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1，試驗(yàn)結(jié)果與前期預(yù)測(cè)結(jié)果均相符。LINC00162在前期TCGA預(yù)測(cè)分析中為上調(diào)，Real-Time PCR試驗(yàn)結(jié)果為下調(diào)。7個(gè)lncRNAs總體預(yù)測(cè)與試驗(yàn)符合率為85.7％。
　　2.2.膀胱癌細(xì)胞株中HAND2-AS1基因的Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果
　　采用定量Real-Time PCR方法檢測(cè)SV-HUC-1，5637，RT4和

20、J82四株細(xì)胞系中HAND2-AS1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示HAND2-AS1確實(shí)在膀胱癌細(xì)胞株中低表達(dá)。
　　2.3.HAND2-AS1對(duì)于膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移的作用。
　　設(shè)計(jì)干擾RNA下調(diào)HAND2-AS1在5637細(xì)胞株中的表達(dá)，結(jié)果顯示干擾后細(xì)胞中HAND2-AS1的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖曲線顯示HAND2-AS1基因下調(diào)后，5637細(xì)胞的增殖明顯加快。同時(shí)，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell法對(duì)比分析，試驗(yàn)初步

21、驗(yàn)證HAND2-AS1抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。
　　結(jié)論：
　　1.基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)大樣本肌層浸潤(rùn)性膀胱癌標(biāo)本數(shù)據(jù)分析，得出肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的差異表達(dá)lncRNA譜及差異表達(dá)miRNA譜，借此構(gòu)建相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)。通過(guò)相關(guān)通路分析證實(shí)，肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中多種lncRNA與miRNA參與相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)，在多項(xiàng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中共同發(fā)揮作用。
　　2.基于TC

22、GA數(shù)據(jù)庫(kù)大樣本肌層浸潤(rùn)性膀胱癌標(biāo)本數(shù)據(jù)分析，得出肌層浸潤(rùn)性膀胱癌差異表達(dá)lncRNA表達(dá)譜，通過(guò)定量Real-Time PCR法初步驗(yàn)證AATBC與UCA1在膀胱癌中表達(dá)顯著上調(diào)，MIR100HG、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1在膀胱癌中表達(dá)顯著下調(diào)，其初步試驗(yàn)結(jié)果與前期數(shù)據(jù)分析結(jié)果均一致。除此7個(gè)lncRNA外，尚有多個(gè)預(yù)測(cè)lncRNA需下一步試驗(yàn)驗(yàn)證。
　　3.基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)大樣本肌層浸