E1A激活基因阻遏子基因調(diào)控肝臟脂肪代謝表型及機(jī)制研究.pdf

1、本研究通過基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究CREG調(diào)控NAFLD的表型及機(jī)制。在研究中，我們運(yùn)用了分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等研究方法，圍繞CREG表達(dá)量與肝組織及細(xì)胞糖代謝、脂肪代謝調(diào)節(jié)關(guān)系，以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)超家族中ASK1-JNK1細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中發(fā)揮的關(guān)鍵性調(diào)控作用等問題進(jìn)行了探討。為CREG基因在治療代謝綜合征-NAFLD系列疾病中的應(yīng)用提供

2、了可行的思路。
　　本研究課題的主要研究方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.CREG基因表達(dá)與NAFLD相關(guān)性研究
　　首先運(yùn)用分子生物學(xué)手段觀察NAFLD模型后肝臟組織和細(xì)胞中CREG表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAFLD模型肝臟組織中CREG基因的mRNA以及蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（HFD0.43±0.04vs NC1.00±0.21，P＜0.05vs NC;HFD2.68±1.04vs NC5.88±0.92，P＜0.05vs NC

3、)。進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，原代肝細(xì)胞中CREG蛋白表達(dá)量與代表細(xì)胞脂肪累積程度的棕櫚酸濃度水平呈負(fù)相關(guān)。在禁食/飽食小鼠模型研究中，禁食24小時(shí)后，脂肪代謝相關(guān)的信號蛋白PEPCK和G6Pase以及CREG蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P＜0.05vs feed)。上述動物模型以及細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)表明，CREG基因及蛋白表達(dá)量與肝臟組織/細(xì)胞中脂肪累積量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　在人體肝臟標(biāo)本CREG蛋白含量檢測顯示，與正常肝臟組織相比，NA

4、FLD組CREG蛋白含量顯著下調(diào)（NAFLD1.00±0.25vs normal2.77±0.34，P＜0.05）。石蠟切片CREG免疫組化研究顯示，CREG主要分布于肝細(xì)胞胞漿，在NAFLD組切片染色中可見CREG蛋白表達(dá)有減少趨勢。
　　以上實(shí)驗(yàn)表明，肝臟細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)脂肪累積的過程中，CREG基因表達(dá)水平以及蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。本部分結(jié)論為CREG基因及蛋白表達(dá)量可能與肝臟脂肪代謝水平相關(guān)。
　　2.CREG基因表達(dá)調(diào)

5、控NAFLD糖代謝、脂肪代謝表型研究
　　首先將CREG肝臟特異性條件性敲除(Conditional knockout，KO)，研究高脂飼養(yǎng)（High fat diet，HFD）情況下糖代謝表型及信號通路改變。KO后高脂飼養(yǎng)后，小鼠體重，肝重/體重，肝臟重量都顯著增加。同時(shí)，KO組葡萄糖耐量和胰島素耐量指標(biāo)異常，空腹血糖和空腹胰島素水平以及HOMA-IR顯著增高。Western-blot分析顯示KO組胰島素信號通路相關(guān)分子Irs1

6、/Akt,GSK3β，F(xiàn)OXO1磷酸化水平均顯著下降。進(jìn)一步的糖原染色顯示糖原在KO后減少。但將CREG肝臟特異性高表達(dá)(Transgenic，TG)后，上述指標(biāo)變化趨勢均被翻轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明，CREG肝臟特異性敲除后HFD可發(fā)生糖代謝紊亂，而CREG高表達(dá)(TG)可顯著改善糖代謝。
　　進(jìn)一步的CREG調(diào)控脂肪代謝研究中，腹部超聲顯示，高脂喂養(yǎng)后KO組小鼠相同觀察點(diǎn)肝臟厚度明顯增加（thickness:4.97±0.25mm v

7、s3.53±0.35mm，P＜0.05）。HE及油紅O染色顯示，KO顯著增加高脂飼養(yǎng)條件下肝臟脂肪累積，而TG組可逆轉(zhuǎn)高脂肪累積現(xiàn)象。同時(shí)，KO-HFD組中游離脂肪酸NEFA，總膽固醇，甘油三酯及肝功指標(biāo)顯著上升，而TG可顯著改善上述指標(biāo)。細(xì)胞學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中原代肝細(xì)胞油紅O及脂肪特異性B ODIPY-C16熒光染色亦證明了CREG敲除后脂肪累積加重，而高表達(dá)CREG可逆轉(zhuǎn)這一趨勢。脂肪代謝相關(guān)信號通路研究中，AMPK及ACC磷酸化水平與

8、CREG表達(dá)量正相關(guān)，mTOR和p70S6K則呈負(fù)相關(guān)。接下來我們檢測了糖代謝、脂肪代謝、炎癥相關(guān)的基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示CREG高表達(dá)后以下基因表達(dá)量上升（ABCG1，CYP7A1，PPAR-α，CPT-1a，ACOX-1，UCP2，IL-10，PDK4），同時(shí)以下基因表達(dá)量下調(diào)(HMGCR，SREBP-1C，F(xiàn)AS，ACCa,CD36，F(xiàn)ATP1，F(xiàn)ABP1，PPAR-γ，PEPCK，G6PC，IL-1b，IL-6，TNF-α，MC

9、P-1)。上述結(jié)果表明，CREG高表達(dá)可顯著改善肝臟組織細(xì)胞內(nèi)的脂肪變性，并可減輕肝臟炎癥反應(yīng)。
　　上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CREG在環(huán)境因素HFD誘發(fā)的肝臟脂肪變性的影響，同時(shí)我們也在遺傳因素導(dǎo)致肥胖的ob/ob小鼠中驗(yàn)證了CREG對糖、脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用。CREG蛋白表達(dá)量在ob/ob小鼠飼養(yǎng)2w，4w，8w，12w四個(gè)時(shí)間點(diǎn)逐漸下調(diào)。而肝臟HE及油紅O染色結(jié)果顯示CREG過表達(dá)可顯著降低脂肪累積水平。CREG高表達(dá)顯著降低血糖和血胰

10、島素水平，改善了ob/ob小鼠的糖代謝紊亂，同時(shí)下調(diào)了血脂水平。以上提示CREG高表達(dá)可改善ob/ob小鼠糖脂代謝紊亂。
　　綜合上述結(jié)果，CREG高表達(dá)可改善肝臟脂肪變性動物模型的糖代謝及脂肪代謝紊亂。
　　3.CREG基因表達(dá)調(diào)控NAFLD糖代謝、脂肪代謝分子機(jī)制研究
　　為明確CREG的具體作用機(jī)制，我們用western blotting技術(shù)同時(shí)在組織和細(xì)胞水平檢測了對肝臟脂肪變性及代謝綜合征起到關(guān)鍵作用的MAP

11、K家族分子MEK，ERK，JNK and P38磷酸化水平，結(jié)果提示，CREG基因敲除組脂肪變性后，JNK磷酸化水平上調(diào)，過表達(dá)CREG后JNK磷酸化水平下降，其他信號分子未見明顯變化。在糖、脂肪代謝表型層面，應(yīng)用JNK特異性抑制劑可完全翻轉(zhuǎn)CREG敲除后的脂肪變性加重趨勢。同時(shí)，我們對人肝臟切片P-JNK和CREG免疫組化染色進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.8686，P＜0.05)。上述結(jié)果提示CREG調(diào)控糖脂

12、代謝的機(jī)制和JNK信號通路密切相關(guān)。
　　接下來，我們進(jìn)一步分析了JNK1和JNK2兩個(gè)亞型在CREG調(diào)控糖脂代謝中的具體作用分工。CREG和JNK1（CREG-JNK1-dual knockout，CREG-JNK1-DKO）或JNK2（CREG-JNK2-dual knockout，CREG-JNK2-DKO）雙敲除小鼠的肝臟HE及油紅O染色顯示，與CREG敲除后高脂飼養(yǎng)組相比，CREG-JNK1-DKO組肝臟脂肪累積減輕，而

13、CREG-JNK2-DKO組無變化。同時(shí)，CREG-JNK1-DKO組翻轉(zhuǎn)了CREG敲除后HFD帶來的體重、肝重/體重、血糖、HOMA-IR等指標(biāo)的惡化趨勢，而CREG-JNK2-DKO無變化。以上提示，CREG對糖脂代謝的調(diào)控作用主要通過JNK1通路完成。
　　為進(jìn)一步研究CREG分子和JNK的作用方式，我們運(yùn)用免疫共沉淀及western blotting技術(shù)驗(yàn)證了肝臟脂肪變性和代謝綜合征中經(jīng)典的信號通路ASK1-MKK4/7-

14、JNK與CREG的共同作用。結(jié)果提示，CREG可以直接與ASK1結(jié)合并調(diào)控其磷酸化水平。同時(shí)我們利用原代肝細(xì)胞研究了CREG于P-ASK1的變化關(guān)系，ASK1磷酸化水平隨著棕櫚酸濃度的增加而升高，CREG與ASK1磷酸化水平呈負(fù)相關(guān)趨勢。以上表明CREG通過與ASK1直接結(jié)合并調(diào)節(jié)其磷酸化水平，進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)控JNK信號通路的作用。
　　綜上所述，本課題首次發(fā)現(xiàn)CREG在肝臟糖代謝及脂肪代謝中的重要作用，并基本闡明了其中CREG-A

15、SK1-JNK信號通路作用機(jī)制。首先，通過動物肝臟脂肪變性及細(xì)胞脂肪變性模型觀察到細(xì)胞脂肪變性時(shí)CREG基因和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，發(fā)現(xiàn)CREG基因表達(dá)可能與肝臟脂肪代謝相關(guān);接下來，通過基因敲除技術(shù)及轉(zhuǎn)基因動物模型控制肝細(xì)胞內(nèi)CREG表達(dá)量，研究其對肝細(xì)胞糖及脂肪代謝的影響，發(fā)現(xiàn)CREG可以改善肝臟脂肪變性動物模型的糖代謝及脂肪代謝紊亂;最后，對CREG調(diào)控糖脂代謝的信號通路分析顯示，CREG可通過直接與ASK1結(jié)合后調(diào)節(jié)其磷酸化水平，進(jìn)