E1A激活基因阻遏子抑制小鼠巨噬細(xì)胞炎癥的自噬-溶酶體調(diào)控機制.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化相關(guān)的心血管疾病是全球死亡率的主要病因。脂質(zhì)功能失調(diào)、動脈脂質(zhì)聚集、免疫-炎癥應(yīng)答是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要原因。巨噬細(xì)胞炎癥在動脈粥樣硬化發(fā)展的各個階段都發(fā)揮重要作用，包括從動脈粥樣硬化始發(fā)到斑塊破裂，從而引發(fā)血栓形成的級聯(lián)效應(yīng)。因此尋找到一種巨噬細(xì)胞炎癥的調(diào)節(jié)因子可能成為動脈粥樣硬化治療的新途徑。
　　E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulated genes

2、，CREG）是一種可對抗腺病毒E1A癌蛋白誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分泌型糖蛋白。我們前期研究工作發(fā)現(xiàn)，在兔和人動脈粥樣硬化血管中CREG蛋白表達(dá)水平均較正常血管降低，并且在兔動脈粥樣硬化病變進(jìn)展過程中，CREG表達(dá)下調(diào)具有時間依賴性。這些結(jié)果提示CREG可能參與了動脈粥樣硬化進(jìn)程。
　　本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，CREG具有抗炎的潛在作用。從NCBI-UniGene網(wǎng)站的EST數(shù)據(jù)庫檢索人和小鼠組織CREG mRNA資料，發(fā)現(xiàn)兩個物種都

3、是在淋巴結(jié)中CREG表達(dá)量最高。淋巴結(jié)是富含巨噬細(xì)胞的組織，因此我們推斷CREG可能對抗巨噬細(xì)胞炎癥，其在動脈粥樣硬化發(fā)病中具有重要作用。
　　本研究擬明確CREG是否參與并可抑制腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥并揭示其可能機制，并評估CREG對動脈粥樣硬化病變是否有干預(yù)作用。
　　材料和方法: RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染CREG siRNA以建立C

4、REG表達(dá)下調(diào)細(xì)胞模型。Western blot檢測CREG，cathepsin B，cathepsin L，溶酶體相關(guān)膜蛋白1（Lysosome-associated membrane protein1，LAMP1），6-磷酸甘露糖/胰島素樣生長因子Ⅱ受體（the mannose6-phosphate/insulin-like growth factor Ⅱ receptor，M6P/IGFIIR），LC3，Beclin1，p62和T

5、ubulin表達(dá)水平。Image-Pro Plus軟件用于免疫印跡定量。小鼠IL-6和MCP-1 ELISA試劑盒檢測IL-6和MCP-1細(xì)胞上清分泌量和組織裂解產(chǎn)物中蛋白表達(dá)量。免疫熒光雙染色后共聚焦顯微鏡觀察His蛋白和cathepsin B/cathepsin L/M6P/IGFIIR/LAMP1的共定位。Lysotracker Red染色觀察溶酶體。電鏡觀察CREG表達(dá)上調(diào)和下調(diào)細(xì)胞中自噬體和自噬溶酶體形成。免疫共沉淀檢測外源性

6、重組CREG蛋白和cathepsin B、cathepsin L、IGFIIR的相互作用。實驗入選40只10周齡，體重20–25g的雄性ApoE-/-小鼠，飼以含21％脂肪、1.3%膽固醇的高脂、高膽固醇飲食16周。在高脂喂養(yǎng)4-12周時，對照組施以假手術(shù)，實驗組用微量滲透泵以30μg/kg/d皮下給予重組CREG蛋白緩釋治療。收集小鼠主動脈油紅O染色及蘇木素伊紅（Hemotoxylin-Esion，HE）染色觀察動脈粥樣硬化斑塊。免疫

7、組織化學(xué)染色觀察動脈粥樣硬化斑塊中CD68和MCP-1表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.CREG表達(dá)與TNF-α誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)有相關(guān)關(guān)系
　　TNF-α是一種具有促炎作用的多效性細(xì)胞因子。首先，為研究探討 TNF-α刺激后，RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌情況，我們在RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中加入20ng/ml TNF-α分別刺激0,30min,2h,6h,12h,16h和24h，收集細(xì)胞上

8、清，ELISA檢測細(xì)胞上清IL-6和MCP-1分泌量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-6和MCP-1分泌量對TNF-α刺激具有時間依賴性。同時在TNF-α刺激過程中，RAW264.7細(xì)胞中CREG表達(dá)先短暫升高，繼而呈時間依賴性降低。CREG表達(dá)變化與TNF-α誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有相關(guān)性，提示CREG可能在TNF-α誘導(dǎo)的炎癥中發(fā)揮重要作用。
　　2.CREG表達(dá)變化干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)
　　為

9、探討CREG對TNF-α誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，我們應(yīng)用了gain-of-function和loss-of-function模型，通過檢測TNF-α刺激后細(xì)胞上清IL-6及MCP-1分泌變化，觀察CREG在RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。當(dāng)在TNF-α刺激的RAW264.7細(xì)胞中添加不同濃度(0,0.5μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml，20μg/ml)的外源性重組CREG蛋白24h后，W

10、estern blot檢測外源重組CREG蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。Western blot檢測證實CREG siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞并用TNF-α刺激后，CREG表達(dá)量較對照組降低82.7%(p<0.001)。ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組CREG蛋白表達(dá)呈劑量依賴性抑制TNF-α刺激后RAW264.7細(xì)胞中IL-6和MCP-1分泌。相反，在轉(zhuǎn)染CREG siRNA下調(diào)CREG表達(dá)變化后，RAW264.7細(xì)胞中IL-6和MCP

11、-1分泌量較對照組增加。上述結(jié)果提示，CREG表達(dá)上調(diào)可減輕炎癥反應(yīng)，而CREG表達(dá)下調(diào)則可以促進(jìn)炎癥因子分泌。因此，CREG可對抗TNF-α誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　3.CREG促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞自噬從而減輕TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)
　　已有研究報道證實，自噬是細(xì)胞對抗炎癥損傷的重要防御機制之一。因此，自噬也可能在巨噬細(xì)胞炎癥中發(fā)揮重要作用。為研究CREG對自噬的影響，我們應(yīng)用gain-of-func

12、tion和loss-of-function模型，用電鏡觀察CREG表達(dá)上調(diào)和CREG表達(dá)下調(diào)的RAW264.7細(xì)胞中自噬體和自噬溶酶體發(fā)生情況，以獲得自噬激活的直接證據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組TNF-α刺激后RAW264.7細(xì)胞中可見自噬泡和自噬體，添加外源性CREG蛋白后細(xì)胞中自噬溶酶體數(shù)量明顯增加，而在轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)CREG表達(dá)的細(xì)胞中則僅見到少量自噬體。同時，Western blot檢測證實，外源性CREG蛋白可誘導(dǎo)自噬，表現(xiàn)為自噬

13、體結(jié)合蛋白LC3 II表達(dá)增加，Beclin1增加，p62降低。p62是一種將泛素結(jié)合物轉(zhuǎn)運至自噬體并在自噬過程中消耗的蛋白。在CREG表達(dá)下調(diào)細(xì)胞中，LC3 II和Beclin1表達(dá)量增加，自噬降解的底物蛋白p62也增加，提示自噬體堆積，自噬功能受損。為研究自噬在 CREG抗炎中的作用，我們應(yīng)用了自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）和bafilomycin A對抗細(xì)胞自噬激活，觀察TNF-α誘導(dǎo)的RAW

14、264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)情況。添加自噬抑制劑3-MA和bafilomycin A后可對抗CREG蛋白的炎癥抑制作用。這些結(jié)果提示自噬在TNF-α誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥中發(fā)揮重要作用，CREG可通過促進(jìn)自噬抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　4.CREG蛋白表達(dá)變化影響RAW264.7細(xì)胞中溶酶體發(fā)生和cathepsin B、cathepsin L的成熟
　　CREG是一種定位于溶酶體的分泌型糖蛋白，為進(jìn)一步驗證CR

15、EG對溶酶體的作用，我們應(yīng)用gain-of-function和loss-of-function模型，觀察CREG對cathepsin B、cathepsin L和LAMP1表達(dá)的影響。免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加外源性CREG蛋白(20μg/ml)后，與對照組相比，RAW264.7細(xì)胞中cathepsin B和cathepsin L熒光強度明顯增加；而在轉(zhuǎn)染CREG siRNA下調(diào)CREG表達(dá)變化后，RAW264.7細(xì)胞中catheps

16、in B和cathepsin L熒光強度明顯降低，表達(dá)量明顯減少。Western blot檢測CREG表達(dá)變化對cathepsin B和cathepsin L的影響，其趨勢與免疫熒光染色結(jié)果相似。在添加外源性CREG蛋白后，與對照組相比，RAW264.7細(xì)胞中cathepsin B、cathepsin L和LAMP1表達(dá)增加；而在轉(zhuǎn)染CREG siRNA下調(diào)CREG表達(dá)變化后，RAW264.7細(xì)胞中cathepsin B、catheps

17、in L和LAMP1表達(dá)明顯降低。同時研究發(fā)現(xiàn)，外源性添加CREG蛋白后cathepsin B(25kDa)和cathepsin L(25kDa)的成熟體增多，成熟體與酶前體比例（25kDa/40 kDa，25kDa/42 kDa）增加（p<0.05，p<0.01）；而在CREG表達(dá)下調(diào)組，cathepsin B(25kDa)和cathepsin L(25kDa)的成熟體減少，成熟體與酶前體比例（25kDa/40 kDa，25kDa/4

18、2 kDa）降低（p<0.05，p<0.05）。以上結(jié)果提示，CREG表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中成熟形式的cathepsin B和cathepsin L表達(dá)，并促進(jìn)LAMP1表達(dá)，而CREG表達(dá)下調(diào)則抑制cathepsin B和cathepsin L成熟，并抑制LAMP1表達(dá)。
　　Lysotracker Red是一種進(jìn)行了熒光標(biāo)記的帶有弱堿性的紅色熒光探針，可以選擇性地滯留在偏酸性的溶酶體中，從而實現(xiàn)對活細(xì)胞溶酶體的特

19、異性熒光標(biāo)記，可用來評估溶酶體數(shù)量。在添加外源性CREG蛋白后，與對照組相比，RAW264.7細(xì)胞中l(wèi)ysotracker紅色熒光強度明顯增加；而在轉(zhuǎn)染CREG siRNA下調(diào)CREG表達(dá)變化后，lysotracker紅色熒光強度明顯降低。上述結(jié)果提示，CREG蛋白表達(dá)變化影響RAW264.7細(xì)胞中溶酶體發(fā)生和cathepsin B、cathepsin L的成熟。由于溶酶體活性對自噬至關(guān)重要，我們推斷CREG可能通過其對溶酶體的影響調(diào)節(jié)

20、自噬過程。
　　5.外源性CREG重組蛋白定位于溶酶體并通過M6P/IGFIIR與溶酶體相互作用，且影響M6P/IGFIIR的細(xì)胞內(nèi)分布
　　以往研究證實，CREG是一種與M6P/IGFIIR直接結(jié)合的溶酶體蛋白，并依賴于與M6P受體的相互作用有效轉(zhuǎn)運至溶酶體。外源性添加CREG蛋白是否與內(nèi)源性CREG蛋白具有相同特性并能與M6P/IGFIIR相互作用尚不清楚。外源性CREG蛋白是帶有His標(biāo)簽并通過與Ni-NTA柱結(jié)合純化

21、的蛋白。為研究外源性CREG蛋白與溶酶體的定位關(guān)系，分別以抗 His抗體與抗cathepsin B、抗cathepsin L、抗LAMP1、抗IGFIIR抗體，對添加了帶有His標(biāo)簽的外源性CREG蛋白的RAW264.7細(xì)胞行免疫熒光雙染，發(fā)現(xiàn)均有明確的共定位關(guān)系。免疫共沉淀提示帶有His標(biāo)簽的CREG蛋白與溶酶體組織蛋白酶cathepsin B、cathepsin L和M6P/IGFIIR有直接相互作用關(guān)系。Western blot檢

22、測CREG表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)后，RAW264.7細(xì)胞中M6P/IGFIIR表達(dá)量與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加外源性CREG蛋白后，IGFIIR標(biāo)記的紅色熒光廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，并與溶酶體結(jié)構(gòu)蛋白LAMP1有共定位關(guān)系；而在CREG表達(dá)下調(diào)的RAW264.7細(xì)胞中，IGFIIR標(biāo)記的紅色熒光主要分布于細(xì)胞核周圍，且與LAMP1僅有部分共定位關(guān)系。以上結(jié)果提示，外源性CREG蛋白導(dǎo)入細(xì)胞后，與內(nèi)源性CREG

23、蛋白具有同樣的溶酶體定位。CREG對M6P/IGFIIR表達(dá)變化無影響，而影響其在細(xì)胞內(nèi)的定位，M6P/IGFIIR對溶酶體的結(jié)合及轉(zhuǎn)運有重要作用，因此，CREG可能通過調(diào)節(jié)M6P/IGFIIR的細(xì)胞內(nèi)定位而影響溶酶體酶的表達(dá)變化和溶酶體發(fā)生，進(jìn)而影響了細(xì)胞自噬和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
　　6.CREG重組蛋白干預(yù)可減輕高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化程度并影響主動脈炎癥及自噬
　　為研究 CREG蛋白對動脈粥樣硬化病變的

24、影響，ApoE-/-小鼠飼以含21%脂肪、1.3%膽固醇的高脂、高膽固醇飼料16周。高脂喂養(yǎng)的4-12周，對照組施行假性手術(shù)，干預(yù)組于小鼠背部皮下埋置滲透性微量泵泵入CREG蛋白。主動脈油紅O染色顯示，CREG蛋白埋泵干預(yù)組小鼠主動脈腔內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊面積較對照組明顯減小。HE染色可觀察到同樣結(jié)果。ELISA檢測CREG蛋白埋泵干預(yù)組小鼠主動脈組織勻漿中MCP-1表達(dá)量較對照組降低。免疫組織化學(xué)染色顯示CREG蛋白埋泵干預(yù)組主動脈根部

25、粥樣硬化斑塊中小鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68和MCP-1陽性區(qū)域占斑塊面積百分比低于對照組。Western blot結(jié)果顯示，外源性CREG蛋白可誘導(dǎo)高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的自噬反應(yīng)，表現(xiàn)為主動脈組織蛋白中自噬體結(jié)合蛋白LC3 II表達(dá)增加，p62降低。以上結(jié)果證實，外源性CREG蛋白干預(yù)可減輕高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化病變程度，抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)自噬，CREG可能通過上述機制發(fā)揮其抗動脈粥樣硬化的治療作用。