人肝臟UGT1A1基因的發(fā)育表達(dá)及表觀遺傳調(diào)控機(jī)制.pdf

1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGTs），是一類(lèi)重要的Ⅱ相代謝酶，可以催化很多種化合物（包括藥物及環(huán)境有毒物質(zhì)）發(fā)生葡萄糖醛酸化結(jié)合反應(yīng)。研究表明，約35％的藥物通過(guò)UGTs代謝。UGTs主要由UGT1A、UGT2A和UGT2B3個(gè)亞家族構(gòu)成。UGT1A1是其中唯一參與膽紅素代謝的酶，此酶活性的完全或部分缺失導(dǎo)致膽紅素不能與葡萄糖醛酸結(jié)合形成結(jié)合膽紅素，使非結(jié)合膽紅素在體內(nèi)堆積，導(dǎo)致

2、Crigler-Najjar綜合征（包括Ⅰ型、Ⅱ型）和Gilbert綜合征。
　　新生兒高膽紅素血癥即新生兒黃疸，是新生兒期最常見(jiàn)的癥狀，發(fā)病率約60-80％。研究顯示，新生兒黃疸原因除了與母乳喂養(yǎng)、低體重、脫水、早產(chǎn)及UGT1A1基因多態(tài)性等有關(guān)外，更主要的是與肝臟UGT1A1發(fā)育不完善、酶活性缺失有關(guān)。這提示進(jìn)行UGT1A1發(fā)育調(diào)控的研究是控制新生兒血膽紅素在正常水平的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　研究證實(shí)組蛋白修飾激活性標(biāo)志H3K4

3、me2促進(jìn)基因活化，而抑制性標(biāo)志H3K27me3則沉默基因表達(dá)。Li等報(bào)道H3K4me2和H3K27me3共同參與了胎鼠及成年鼠Cyp3a基因的發(fā)育表達(dá)調(diào)控。但就肝臟UGT1A1的發(fā)育表達(dá)調(diào)控而言，有關(guān)表觀遺傳修飾機(jī)制方面的研究目前還未見(jiàn)報(bào)道。
　　綜上所述，表觀遺傳修飾參與UGT1A1表達(dá)調(diào)控的機(jī)制研究尚處于起步階段，本研究將探討人肝臟發(fā)育過(guò)程中UGT1A1的動(dòng)態(tài)變化以及組蛋白修飾參與UGT1A1基因發(fā)育調(diào)控的機(jī)制。表觀遺傳調(diào)控

4、是引起藥物代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)個(gè)體差異的重要原因，藥物代謝酶的表觀修飾調(diào)控機(jī)制的深入研究，有助于臨床藥物的合理應(yīng)用及不良反應(yīng)的減少，為兒童患者發(fā)展個(gè)體化治療策略提供新的理論依據(jù)。本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述:
　　第一部分:轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控人肝臟發(fā)育過(guò)程中UGT1A1的動(dòng)態(tài)表達(dá)
　　目的:
　　UGT1A1是肝臟中參與膽紅素葡萄糖醛酸化反應(yīng)唯一的Ⅱ相酶，此酶活性的完全或部分缺失可以導(dǎo)致非結(jié)合型高膽紅素血癥。本部分研究UGT1A

5、1及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在人肝臟發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，并分析它們之間是否存在相關(guān)性，探討轉(zhuǎn)錄因子發(fā)育表達(dá)對(duì)UGT1A1的動(dòng)態(tài)表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1.收集90例中國(guó)漢族人群肝臟標(biāo)本，其中成人肝臟樣本41例（34-72歲），兒童肝臟樣本8例（3個(gè)月-2歲）和胎兒期肝臟樣本41例（18-38孕周）。
　　2.采用qRT-PCR方法檢測(cè)肝臟標(biāo)本中UGT1A1及PXR、CAR、HNF1A、HNF4A和PPARA等轉(zhuǎn)錄因子的mR

6、NA表達(dá)情況，分析UGT1A1表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平之間的相關(guān)性。
　　3.采用western blot法及HPLC法檢測(cè)肝臟標(biāo)本中UGT1A1的蛋白表達(dá)水平及體外酶活性。
　　4.采用直接測(cè)序法檢測(cè)UGT1A1*6（211G[]A）及UGT1A1*28（TA6[] TA7）遺傳多態(tài)性。
　　結(jié)果:
　　1.人肝臟發(fā)育過(guò)程中UGT1A1 mRNA、蛋白水平及酶活性的動(dòng)態(tài)表達(dá)。UGT1A1表達(dá)在胎兒期很低，在兒

7、童期和成人期顯著增高。與胎兒期相比，兒童期和成人期UGT1A1的mRNA、蛋白及酶活性分別增高了120倍、20倍和10倍。
　　2.人肝臟發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平及其與UGT1A1的相關(guān)性。轉(zhuǎn)錄因子PXR、CAR、HNF1A、HNF4A和PPARA等表達(dá)水平在人肝臟的各發(fā)育階段與UGT1A1表達(dá)水平一致，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)表達(dá)。與胎兒組相比，兒童組和成人組轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平顯著增高。轉(zhuǎn)錄因子PXR、CAR、HNF1A、HNF4A及PPAR

8、A等表達(dá)水平與UGT1A1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均呈正性相關(guān)。
　　3.基因多態(tài)性對(duì)UGT1A1表達(dá)的影響。UGT1A1*6和UGT1A1*28使UGT1A1的mRNA、蛋白表達(dá)水平及酶活性降低了約40-60％。
　　結(jié)論:
　　1.在人肝臟的發(fā)育過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子參與了UGT1A1基因的發(fā)育調(diào)控。
　　2.UGT1A1*6和UGT1A1*28顯著降低了UGT1A1的表達(dá)水平及酶活性。
　　第二部分:組蛋白

9、修飾參與調(diào)控人肝臟發(fā)育過(guò)程中UGT1A1的動(dòng)態(tài)表達(dá)
　　目的:
　　組蛋白甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳修飾，組蛋白修飾激活性標(biāo)志物H3K4me2促進(jìn)所在基因的活化，而抑制性標(biāo)志物H3K27me3則抑制基因的表達(dá)。研究在人肝臟發(fā)育過(guò)程中胎兒期及成人期UGT1A1基因中組蛋白修飾富集峰的差異，初步探討組蛋白修飾對(duì)UGT1A1的動(dòng)態(tài)表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1.隨機(jī)選取4例肝臟樣本（包含胎兒期及成人期各2例），選

10、用特異性抗體H3K4me2和H3K27m3，進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)實(shí)驗(yàn)。
　　2.將得到的富集DNA送深圳華大公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　3.進(jìn)行胎兒和成人肝臟H3K4me2及H3K27m3組蛋白修飾的全基因組圖譜分析。
　　4.隨機(jī)選取3例胎兒肝臟樣本和3例成人肝臟樣本，用設(shè)計(jì)的引物分別進(jìn)行CHIP-qPCR檢測(cè)，驗(yàn)證CHIP-seq實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1.

11、H3K4me2在胎兒及成人肝臟富集峰差異分布。H3K4me2在成人肝臟UGT1A1基因的啟動(dòng)子區(qū)附近有一個(gè)長(zhǎng)度為5873 bp的富集峰;H3K4me2在轉(zhuǎn)錄因子HNF1A、HNF4A、GR、PXR、PPARA、CAR和RXRA等基因有一個(gè)或多個(gè)富集峰。
　　2.H3K27me3在胎兒及成人肝臟富集峰差異分布。H3K27me3在胎兒肝臟UGT1A1基因的啟動(dòng)子區(qū)上游12 kb附近有一個(gè)長(zhǎng)度為226 bp的富集峰;H3K27me3在轉(zhuǎn)

12、錄因子GR、CAR、RXRA、HNF4A等基因有一個(gè)或多個(gè)富集峰。
　　3.CHIP-qPCR驗(yàn)證ChIP-seq結(jié)果的可靠性。與胎兒肝臟相比，H3K4me2在成人肝臟的平均富集倍數(shù)是3.2;而與成人相比，H3K27me3在胎兒肝臟的平均富集倍數(shù)是3.7，可見(jiàn)CHIP-qPCR結(jié)果與CHIP-seq結(jié)果一致，證實(shí)了CHIP-seq實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)論:
　　組蛋白修飾H3K4me2與H3K27me3參與調(diào)控了肝

13、臟發(fā)育過(guò)程中UGT1A1的動(dòng)態(tài)表達(dá)。
　　第三部分:組蛋白修飾調(diào)控人肝臟發(fā)育過(guò)程中UGT1A1動(dòng)態(tài)表達(dá)的分子機(jī)制
　　目的:
　　第二部分研究發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾H3K4me2及H3K27me3參與了肝臟UGT1A1動(dòng)態(tài)發(fā)育的表達(dá)調(diào)控，但組蛋白修飾參與UGT1A1基因的發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制不清，該部分?jǐn)M用siRNA、CHIP-seq及Co-IP等方法探討轉(zhuǎn)錄因子是否募集組蛋白修飾酶等調(diào)控UGT1A1的基因表達(dá)。
　　方法

14、:
　　1.借助轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)HNF1A表達(dá)，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h-48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR、Co-IP或CHIP分析。
　　2.選用特異性抗體將轉(zhuǎn)染siRNA48 h后收集的細(xì)胞，使用特異性H3K4me2、H3 Acetylation、HNF1A及NCOA6抗體，進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀處理，收集富集的DNA片段，進(jìn)行qRT-PCR分析，探討轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)HNF1A表達(dá)前后在UGT1A1基因組蛋白修飾

15、H3K4me2及H3 Acetylation、核受體輔調(diào)節(jié)因子NCOA6及轉(zhuǎn)錄因子HNF1A的變化。
　　3.將轉(zhuǎn)染siRNA48 h后收集的細(xì)胞進(jìn)行Co-IP檢測(cè)，探討轉(zhuǎn)錄因子HNF1A與組蛋白甲基化酶MLL1、以及HNF1A與核受體輔調(diào)節(jié)因子NCOA6是否存在相互作用。
　　4.檢測(cè)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2表達(dá)水平及UGT1A1表達(dá)水平，并進(jìn)行二者相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1.siRNA干擾后檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞

16、內(nèi)HNF1A及UGT1A1基因的表達(dá)。在HepG2及LS174T兩個(gè)細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染siHNF1A組與陰性對(duì)照相比，HNF1A及UGT1A1蛋白表達(dá)水平下降了約70-80％。
　　2.siHNF1A干擾對(duì)UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾的影響。在HepG2及LS174T兩種細(xì)胞系中，siHNF1A組與陰性對(duì)照組相比，在UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)的HNF1A結(jié)合位點(diǎn)附近(-181～-1)的H3K4me2及H3 Acetylation、

17、轉(zhuǎn)錄因子HNF1A及核受體輔調(diào)節(jié)因子NCOA6的富集均明顯下降。
　　3.Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在LS174T細(xì)胞及HepG2細(xì)胞中，MLL1與HNF1A存在相互作用;NCOA6與HNF1A存在相互作用。
　　4.組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2與UGT1A1表達(dá)水平的相關(guān)性分析。EZH2蛋白在胎兒組呈現(xiàn)高表達(dá)，而在成人組呈低表達(dá)，而UGT1A1在胎兒組呈現(xiàn)低表達(dá)，而在成人組呈高表達(dá)。EZH2蛋白表達(dá)水平與UGT1A1 mRNA及蛋白