腸系膜淋巴結(jié)CD169+巨噬細(xì)胞在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　炎癥性腸疾病(inflammatory bowel disease，IBD)，是一種主要發(fā)生在腸道的慢性的，易復(fù)發(fā)的免疫性疾病，潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)是IBD的兩種最主要的發(fā)病形式，發(fā)病時(shí)伴隨反復(fù)腹痛不適，疲乏，黏液性血便等。雖然環(huán)境因素，腸道微生物菌群，遺傳因素以及免疫系統(tǒng)的相關(guān)作用，在IBD的發(fā)病過程中均起到一定的作用，但是其

2、具體的機(jī)制還不完全清楚。近年來，IBD的發(fā)病率在全球逐漸升高，且長(zhǎng)期患有IBD的患者極易誘發(fā)結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)。
　　天然免疫和適應(yīng)性免疫在IBD的發(fā)病中都起著顯著的作用，其中腸道組織不同的巨噬細(xì)胞亞群在不同的條件下其功能具有多樣性。CD169(唾液酸黏附素，Siglec-1)是唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)家族的第一個(gè)成員，可特異性識(shí)別唾液酸配基，在小鼠體內(nèi)主要表達(dá)在次級(jí)淋巴器官

3、巨噬細(xì)胞表面，比如淋巴結(jié)被膜下淋巴竇(subcapsular sinus，SCS)，脾臟邊緣區(qū)(marginalzone)，以及淋巴組織外的其它一些部位，如結(jié)腸固有層(lamina propria，LP)。在這些部位，CD169+巨噬細(xì)胞起著哨衛(wèi)的作用，識(shí)別進(jìn)入的病原體抗原，激活淋巴細(xì)胞，及抗病原體的免疫反應(yīng)。在腸道系統(tǒng)免疫反應(yīng)中，腸系膜淋巴結(jié)(mesentericlymph node，mLNs)是重要的誘導(dǎo)性位點(diǎn)，攜帶病原體的抗原提呈

4、細(xì)胞在淋巴結(jié)中可識(shí)別并激活天然T淋巴細(xì)胞，使其分化并增殖為炎性T淋巴細(xì)胞，比如Th1，Th2或者是Th17細(xì)胞，這些炎性T淋巴細(xì)胞可被募集至腸道組織中，促進(jìn)IBD的發(fā)病。但是分布于mLNs中的CD169+巨噬細(xì)胞在黏膜免疫中的作用仍未見有詳細(xì)的報(bào)道。因此本研究致力于探索腸系膜淋巴結(jié)中CD169+巨噬細(xì)胞在IBD中的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制。
　　研究目的:
　　利用DSS誘導(dǎo)的IBD動(dòng)物模型，研究mLNs CD169+巨噬細(xì)胞在小

5、鼠結(jié)腸炎發(fā)病過程中的作用，探究IBD的發(fā)病原因及致病機(jī)制，從而為揭示IBD的復(fù)雜病因和病理機(jī)制提供具有學(xué)術(shù)理論價(jià)值和臨床應(yīng)用潛能的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　研究方法:
　　將3.5％ DSS水溶液給予WT小鼠和CD169-DTR小鼠自由飲用，三天或七天，建立小鼠結(jié)腸炎動(dòng)物模型。每天檢測(cè)小鼠的體重變化并觀察記錄小鼠的發(fā)病情況。首先，利用流式分析，免疫熒光和Q-PCR的方法檢測(cè)WT小鼠結(jié)腸炎發(fā)病過程中CD169+巨噬細(xì)胞在mLNs中的數(shù)量

6、變化，明確腸系膜淋巴結(jié)CD169+巨噬細(xì)胞在小鼠結(jié)腸炎的發(fā)病過程中起著重要的作用。然后，運(yùn)用流式，Q-PCR和免疫熒光的方法檢測(cè)注射白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)對(duì)CD169-DTR小鼠中CD169+巨噬細(xì)胞特異性刪除效果，對(duì)WT小鼠和CD169-DTR小鼠結(jié)腸炎模型，進(jìn)行組織學(xué)和病理學(xué)比較，明確腸系膜淋巴結(jié)CD169+巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)腸炎發(fā)病的作用。最后，通過流式，Q-PCR，ELISA的方法檢測(cè)兩種模型腸系膜淋巴結(jié)炎

7、性細(xì)胞數(shù)量變化和細(xì)胞因子趨化因子的表達(dá)變化，探究CD169+巨噬細(xì)胞調(diào)控結(jié)腸炎發(fā)病的作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　首先，DSS能夠成功的誘導(dǎo)WT小鼠結(jié)腸炎模型，結(jié)果顯示，與正常飼養(yǎng)的小鼠相比，給予DSS的小鼠mLNs中，浸潤的炎性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，炎性細(xì)胞因子如IL-17，IL-21，IL-23，IL-6，IL-1β，TNF-α，IL-12，IL-18和趨化因子如CCL8，CCL3表達(dá)量顯著升高，抑炎性的趨化因子CCL22

8、表達(dá)量明顯降低。而且， mLNs CD169+巨噬細(xì)胞的比例明顯增加，免疫熒光實(shí)驗(yàn)揭示CD11b+CD169+巨噬細(xì)胞主要分布于腸系膜淋巴結(jié)被膜下淋巴竇的區(qū)域。但是，在DT注射的CD169-DTR小鼠中，CD169+巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯下降，和WT小鼠結(jié)腸炎模型相比，給予DSS的CD169-DTR小鼠體重下降程度，結(jié)腸縮短長(zhǎng)度，及結(jié)腸組織損傷程度明顯降低，而且mLNs中炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，即DSS不能成功誘導(dǎo)小鼠建立典型的結(jié)腸炎模型，揭

9、示CD169+巨噬細(xì)胞在IBD的發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，和WT結(jié)腸炎小鼠mLNs相比，CD169-DTR小鼠mLNs中CCL22表達(dá)水平明顯升高，Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子如IL-17，IL-23，IL-21表達(dá)水平和Th17細(xì)胞的數(shù)量顯著下降。并且體外實(shí)驗(yàn)證明，WT結(jié)腸炎小鼠mLNs和結(jié)腸組織的培養(yǎng)上清可以促進(jìn)CD169-DTR小鼠mLNs細(xì)胞和結(jié)腸組織炎性細(xì)胞因子，如IL-17，TNF-α，IL-1β和趨化因子

10、如CCL8，CCL3的表達(dá)，但是卻抑制了CD169-DTR小鼠mLNs細(xì)胞CCL22的表達(dá)。流式分選實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明CD169+巨噬細(xì)胞能夠主導(dǎo)性的分泌炎性細(xì)胞因子，如IL-17，TNF-α，IL-1β。
　　結(jié)論:
　　本課題的研究結(jié)果表明在小鼠結(jié)腸炎模型中，mLNs腸系膜淋巴結(jié)被膜下淋巴竇(SCS) CD169+巨噬細(xì)胞在黏膜炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用，mLNs中的CD169+巨噬細(xì)胞亞群在結(jié)腸炎模型中的數(shù)量顯著升