小柴胡湯干預(yù)化療藥物伊立替康所致遲發(fā)性腹瀉的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：伊立替康（Irinotecan，CPT-11）是臨床大腸癌常用的化療藥，其劑量限制性毒性反應(yīng)為遲發(fā)性腹瀉，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和對化療的耐受。
　　本研究目的：1.建立 CPT-11所致小鼠遲發(fā)性腹瀉模型；2.探討預(yù)先灌胃小柴胡湯對CPT-11所致小鼠遲發(fā)性腹瀉是否有預(yù)防作用；3.通過超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass

2、 Spectrometry，UPLC-MS/MS）測定CPT-11及其代謝產(chǎn)物以及小柴胡湯中有效成分含量，探尋小柴胡湯作用于遲發(fā)性腹瀉的物質(zhì)基礎(chǔ)，為機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1.建立小鼠遲發(fā)性腹瀉模型：健康雄性C57BL6小鼠20只，適應(yīng)性飼喂高脂飼料三周后，隨機(jī)分為模型組(n=10)和正常組(n=10)，連續(xù)腹腔注射CPT-117天，每天一次，劑量為50 mg·kg-1，正常組腹腔注射等量的右旋糖苷40葡萄糖注射液，每天觀察

3、小鼠的肛門，拍照記錄，收集糞便，用尿糞便隱血試劑盒測定血便情況。2.小柴胡湯干預(yù)研究：健康雄性 C57BL6小鼠40只，適應(yīng)性飼喂高脂飼料三周后，隨機(jī)分為4組，每組10只：空白對照組（等容生理鹽水），遲發(fā)性腹瀉模型組（等容生理鹽水），小柴胡湯組（1500 mg·kg-1·d-1），洛哌丁胺組（0.5333 mg·kg-1·d-1），連續(xù)灌胃17天，每天1次。于實(shí)驗(yàn)第4~10天，除空白對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射CPT-117天誘導(dǎo)遲

4、發(fā)性腹瀉。在注射CPT-11的第0、2、4、6、8、10天取小鼠尾尖血，置預(yù)涂肝素的微量離心管（eppendorf tube，EP管）中，取血時(shí)間為注射后2 h。觀察小鼠體重變化，收集糞便用尿糞便隱血試劑盒測定血便，實(shí)驗(yàn)第18天所有小鼠乙醚麻醉后取心臟血，置預(yù)涂肝素的EP管中，為尋找CPT-11代謝產(chǎn)物，測定小柴胡湯有效成分含量，然后處死小鼠取的肝臟、腎臟、大腸、小腸組織，分為兩部分保存，一部分凍存于-80℃冰箱，用于測量組織中藥物含量

5、；另一部分存于4%甲醛溶液，用于制作病理切片，了解組織損傷。3.采用UPLC-MS/MS方法，測定組織及血液樣品中CPT-11及其代謝產(chǎn)物和小柴胡湯中有效成分的含量。
　　結(jié)果：1.遲發(fā)性腹瀉模型建立：①與正常組相比，模型組小鼠皮毛污穢、潮濕、結(jié)塊，身體發(fā)抖，抓拿時(shí)不掙扎， 肛門烏黑紅腫；②正常組小鼠體重上升了0.57±0.41 g，模型組小鼠下降了5.98±2.08 g；③正常組小鼠血便率為0，模型組于連續(xù)腹腔注射CP

6、T-11后第7天血便率達(dá)100%（P<0.01）。2.小柴胡湯干預(yù)研究：①體重比較：第1天和第4天各組小鼠體重?zé)o明顯差異（P>0.05），第10天空白對照組小鼠體重高于其他組小鼠（P<0.05），說明遲發(fā)性腹瀉模型能導(dǎo)致小鼠體重顯著降低；第17天空白對照組小鼠體重仍高于其他組（P<0.05），但小柴胡湯組小鼠體重高于模型對照組（P<0.05），說明小柴胡湯能一定程度地減輕小鼠體重降低的癥狀；②血便率：正常對照組、模型對照組、小柴胡湯組、

7、洛哌丁胺組血便率分別為0%、100%、50%、60%；實(shí)驗(yàn)第8~17天，小柴胡湯組和洛哌丁胺組小鼠血便率均顯著低于模型對照組（P<0.01），且小柴胡湯組小鼠血便率低于洛哌丁胺組（P<0.05）；③病理組織學(xué)觀察：空白對照組小鼠大腸和小腸結(jié)構(gòu)完整，模型對照組小鼠大腸和小腸黏膜上皮細(xì)胞伴明顯彌漫性壞死脫落和炎癥細(xì)胞浸潤，小柴胡湯組和洛哌丁胺組小鼠腸黏膜組織均趨于正常；連續(xù)注射CPT-117天對肝臟和腎臟無明顯損傷。3.藥物濃度含量測定：①

8、CPT-11及其代謝產(chǎn)物：小柴胡湯組小鼠注射CPT-11第6天時(shí)CPT-11血藥濃度最高，與模型對照組第4天的最高濃度沒有顯著性差異（P<0.05）；模型對照組SN-38最高濃度是實(shí)驗(yàn)組的7倍；模型對照組注射CPT-11第4天時(shí)SN-38G血藥濃度最高，而小柴胡湯組是第6天，顯著高于模型對照組（P<0.05），除了第4天實(shí)驗(yàn)組血藥濃度比對照組低外，其他天數(shù)實(shí)驗(yàn)組血藥濃度均高于對照組；模型對照組CPT-11濃度在各組織中排序?yàn)樾∧c>肝>腎

9、>大腸，SN-38和SN-38G濃度在各組織中排序?yàn)樾∧c>腎>大腸>肝，模型對照組小鼠CPT-11、SN-38、SN-38G均在小腸中分布最多（P<0.05），小柴胡湯組CPT-11濃度在各組織中排序?yàn)楦?腎>小腸>大腸，SN-38和SN-38G濃度在各組織中排序?yàn)楦?小腸>腎>大腸，小柴胡湯組小鼠 CPT-11、SN-38、SN-38G這三種物質(zhì)均在肝中分布最多（P<0.05），小柴胡湯組各成分在各組織的含量均顯著小于模型對照組；②小

10、柴胡湯中17種有效成分：注射CPT-11后0、2、4、6天血液中只能測到14種成分，黃芩苷、槲皮素和黃芩苷元這三種成分在檢測限以下，而各組織中均可以測到這3種成分，提示這3種成分具有器官靶向性；甘草酸的血藥濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他成分，在各組織中只少量存在，可能是甘草酸主要在血液中代謝。在肝中漢黃芩素的濃度最高（21700.7430 ng/mL），而柴胡皂苷a的濃度最低（12.4930 ng/mL）；在腎臟中人參皂苷Rd的濃度最高（21563.

11、0884 ng/mL），柴胡皂苷a的含量最低（20.7965 ng/mL）；在大腸中漢黃芩素的濃度最高（26370.0697 ng/mL），柴胡皂苷a的含量最低（3.7625 ng/mL）；在小腸中人參皂苷 Rd的濃度最高（22622.3167 ng/mL），人參皂苷 Rg1的含量最低（45.0834 ng/mL）。
　　結(jié)論：1.首次使用C57BL6小鼠，適應(yīng)性飼喂高脂飼料三周后腹腔注射CPT-1150 mg/kg，連續(xù)7天，每

12、天一次，能成功建立CPT-11所致遲發(fā)性腹瀉小鼠模型；2.小柴胡湯能預(yù)防CPT-11所致小鼠血便，使遲發(fā)性腹瀉小鼠體重正常增長、降低血便率、改善腸組織損傷；3.小柴胡湯中含有17種活性成分，主要干預(yù)SN-38的代謝，能抑制CPT-11、SN-38、SN-38G的膽汁外排并加速這三種物質(zhì)的消除；CPT-11的腸肝循環(huán)能引起遲發(fā)性腹瀉，小柴胡湯預(yù)防CPT-11所致遲發(fā)性腹瀉是多個(gè)靶器官共同作用的，可能與抑制腸肝循環(huán)有關(guān)，可為后續(xù)作用機(jī)制研究