南蛇藤莖提取物調(diào)控Notch1抑制肝癌血管擬態(tài)的作用及機(jī)制.pdf

1、引言
　　原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高度異質(zhì)性、癌性血管豐富的惡性實(shí)體腫瘤，早期診斷率低。根治性切除或肝臟移植后大部分病例在2年內(nèi)形成肝內(nèi)復(fù)發(fā)或肝外轉(zhuǎn)移，5年生存率較低。中晚期患者由于受基礎(chǔ)肝功能的影響，目前尚缺乏反應(yīng)率高且相對(duì)安全的治療措施。因此肝癌的綜合治療策略亟待進(jìn)一步研究及補(bǔ)充。
　　傳統(tǒng)的抗內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管(endothelial dependent ves

2、sel，EDV)生成在實(shí)體腫瘤治療中的不理想，提示了可能存在另外一種相對(duì)獨(dú)立的微血管系統(tǒng)參與腫瘤血供。擬態(tài)血管(vasculogenic mimicry，VM)是由腫瘤細(xì)胞獨(dú)立形成的、參與腫瘤血供及轉(zhuǎn)移的微血管結(jié)構(gòu)，它的形成是腫瘤細(xì)胞自身塑性改變以及腫瘤細(xì)胞與局部微環(huán)境相互作用的結(jié)果，多種腫瘤基因及血管生成調(diào)節(jié)基因參與其中。惡性腫瘤中VM的形成多與不良預(yù)后密切相關(guān)。
　　Notch基因目前發(fā)現(xiàn)4種(Notch1-4)亞結(jié)構(gòu)，是哺乳

3、動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中重要的調(diào)控基因。在胚胎后的腫瘤形成及進(jìn)展、組織纖維化、血管生成中發(fā)揮重要作用。Notch基因在黑色素瘤及乳腺癌的血管擬態(tài)中均發(fā)揮重要作用。而關(guān)于Notch1在肝癌血管擬態(tài)形成中的作用及機(jī)制，目前鮮有報(bào)道。
　　肝癌中醫(yī)稱為肝積，屬于現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合理論中的絡(luò)病范疇。肝癌的血管生成是一種病絡(luò)的綜合表現(xiàn)，其病機(jī)要素為“虛、瘀、毒”。病絡(luò)是肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的主要途徑。理論上講肝癌的血管擬態(tài)亦是一種病絡(luò)。根據(jù)“辛以通絡(luò)”原則

4、，辛藥具有活血祛瘀、解毒散結(jié)功效的可發(fā)揮抑制病絡(luò)的作用。目前一些基礎(chǔ)研究顯示具備上述性味的中藥能夠抑制血管擬態(tài)的形成。
　　南蛇藤（Celastrus Orbiculatus Thunb）系衛(wèi)茅科藤屬藥用植物，全草入藥，苦溫微辛，入肝與膀胱經(jīng)，功能行氣活血、祛毒消腫。課題組前期的研究證實(shí)南蛇藤莖乙酸乙酯提取物(Celastrus Orbiculatus Extraction，COE)能夠抑制肝癌的內(nèi)皮依賴性血管生成;抑制胃癌細(xì)胞的

5、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）減少胃癌裸鼠模型的轉(zhuǎn)移。但是，關(guān)于COE能否調(diào)控Notch1抑制肝癌的血管擬態(tài)，目前未檢索到相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究圍繞這一核心問(wèn)題，從以下四個(gè)部分展開相應(yīng)的研究，力圖證實(shí):1）Notch1在肝癌血管擬態(tài)中的作用及可能的機(jī)制;2）COE能否通過(guò)調(diào)控Notch1抑制血管擬態(tài)，進(jìn)而抑制肝癌的生長(zhǎng)。通過(guò)本課題的開展，以期為肝癌的中醫(yī)藥治療提供理

6、論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本課題共分為四個(gè)研究部分。
　　第一部分 Notch1在肝癌組織中的表達(dá)及其與血管擬態(tài)的關(guān)系
　　目的:
　　檢測(cè)Notch1及其下游靶蛋白Hes1、EMT相關(guān)蛋白E—cadherin及vimentin在肝癌組織中的表達(dá)水平，分析Nctch1、EMT與肝癌VM的相關(guān)性;揭示VM在肝癌進(jìn)展預(yù)后中的臨床意義。
　　方法:
　　收集肝癌手術(shù)標(biāo)本，并根據(jù)標(biāo)本來(lái)源信息對(duì)患者進(jìn)行追蹤隨訪。免疫

7、組織化學(xué)染色(immunohistochemical staining，IHC)檢測(cè)Notch1、Hes1及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，以RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。PAS-CD34雙染色檢測(cè)VM，分析各蛋白表達(dá)水平與VM的相關(guān)性。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制肝癌患者術(shù)后生存曲線，比較有無(wú)VM對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的影響。
　　結(jié)果:
　　在收集的44例肝癌標(biāo)本中，Notch1及Hes1在肝癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織明顯上調(diào)(P＜0.001

8、)。共17例(38.64％，17/44)檢出VM結(jié)構(gòu)，Notch1、Hes1的表達(dá)水平與VM檢出率呈正性相關(guān)(r=0.590，0.568，P＜0.001、0.001)。12例(27.27％，12/44)檢出肝癌細(xì)胞中vimentin表達(dá)，陽(yáng)性率與VM呈正性相關(guān)(r=0.963，P＜0.001)。Notch1表達(dá)水平在Vimentin陽(yáng)性標(biāo)本中顯著提高(P＜0.001)。Kaplan-Meier生存分析顯示Notch1、Hes1表達(dá)升高及

9、VM陽(yáng)性提示肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)。
　　結(jié)論:
　　VM的出現(xiàn)會(huì)提示肝癌術(shù)后的早期復(fù)發(fā)，Notch1表達(dá)上調(diào)與肝癌EMT轉(zhuǎn)化及VM的形成存在相關(guān)性。
　　第二部分 Notch1對(duì)肝癌細(xì)胞體外血管擬態(tài)的影響
　　目的:
　　研究Notch1在肝癌細(xì)胞體外血管擬態(tài)中發(fā)揮的作用，探討其促進(jìn)肝癌細(xì)胞血管擬態(tài)的機(jī)制。
　　方法:
　　通過(guò)體外三維培養(yǎng)比較低侵襲人肝癌細(xì)胞HepG2和高侵襲人肝癌細(xì)胞MHCC97

10、-H的小管形成能力，以RT-PCR及Western Blot比較兩種細(xì)胞的Notch1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平，確定實(shí)驗(yàn)靶細(xì)胞。繼而以慢病毒載體表達(dá)技術(shù)實(shí)現(xiàn)HepG2細(xì)胞中Notch1過(guò)表達(dá)，MHCC97-H細(xì)胞中Notch1消減表達(dá)，獲得HepG2/Notch1+及MHCC97-H/Notch1-轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過(guò)三維培養(yǎng)比較轉(zhuǎn)化細(xì)胞的血管擬態(tài)能力;以熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞F-actin骨架蛋白，以RT-PCR及Weatern Blot檢測(cè)vi

11、mentin及E-cadherin的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，觀察調(diào)控Notch1后肝癌細(xì)胞自身塑形的變化。最后，以TGF-β1誘導(dǎo)，觀察Notch1表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞VM形成及EMT的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　低侵襲潛能的HepG2細(xì)胞Notch1表達(dá)水平低于高侵襲潛能的MHCC97-H細(xì)胞，不具備體外VM形成能力。在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Notch1后細(xì)胞EMT潛能增加，獲得體外VM形成能力;TGF-β1可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生EMT

12、，在此過(guò)程中Notch1表達(dá)水平升高并出現(xiàn)血管擬態(tài)。在高表達(dá)Notch1的MHCC97-H細(xì)胞中敲低Notch1，肝癌細(xì)胞EMT及VM形成潛能受抑，對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT及VM形成反應(yīng)性降低。
　　結(jié)論:
　　Notch1的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT，進(jìn)而導(dǎo)致VM形成，下調(diào)Notch1可阻止肝癌細(xì)胞EMT，抑制肝癌細(xì)胞VM發(fā)育。
　　第三部分 Notch1在人肝癌裸鼠皮下移植瘤內(nèi)血管擬態(tài)中的作用
　　目的

13、:
　　從整體水平探討Notch1與肝癌VM形成的關(guān)系。
　　方法:
　　應(yīng)用本研究第二部分構(gòu)建的轉(zhuǎn)化細(xì)胞HepG2/vector、 HepG2/Notch1+、MHCC97-H/vector、MHCC97-H/Notch1-細(xì)胞分別接種至裸鼠左前腋下，形成不同人肝癌細(xì)胞系的裸鼠皮下移植瘤模型。每隔2d測(cè)量移植瘤長(zhǎng)短徑，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。造模后第28d活體熒光觀察皮下移植瘤生長(zhǎng)情況。處死動(dòng)物，剝?nèi)∫浦擦龇Q重。移植瘤組織

14、病理學(xué)觀察;PAS-CD34雙染色及透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察移植瘤內(nèi)VM結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)移植瘤組織內(nèi)EMT標(biāo)志物vimentin及E-cadherin的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　HepG2/Notch1+移植瘤在造模后笫20d生長(zhǎng)加速，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)移植瘤體積及瘤質(zhì)量均大于HepG2/vector;相反，MHCC97-H/Notch1-移植瘤在造模后第2

15、0d生長(zhǎng)開始慢于MHCC97-H/vector，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)瘤體積及質(zhì)量均小于MHCC97-H/vector。低表達(dá)Notch1的HepG2/vector和MHCC97-H/Notch1-移植瘤內(nèi)點(diǎn)、片狀壞死明顯，未觀察到典型的VM結(jié)構(gòu)。免疫組化染色顯示HepG2/Notch1+及MHCC97-H/vector移植瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞vimentin著色強(qiáng)度及著色比例高于HepG2/vector及MHCC97-H/Notch1-移植瘤;相應(yīng)的，

16、E-cadherin的著色比例及強(qiáng)度在HepG2/Notch1+及MHCC97-H/vector移植瘤內(nèi)也較低。
　　結(jié)論:
　　Notch1可促進(jìn)入肝癌裸鼠皮下移植瘤中的VM形成，抑制Notch1表達(dá)可減少VM，抑制腫瘤生長(zhǎng)。
　　第四部分南蛇藤莖提取物調(diào)控Notch1抑制肝癌血管擬態(tài)
　　目的:
　　通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，證實(shí)南蛇藤莖提取物(COE)下調(diào)Notch1表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞EMT

17、，減少VM形成，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。
　　方法:
　　體外實(shí)驗(yàn)中，首先應(yīng)用CCK-8及活細(xì)胞工作站分析COE對(duì)MHCC97-H細(xì)胞增殖及匯合的抑制，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇低于IC50的三組COE濃度(20、40、80μg/mL)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，陽(yáng)性對(duì)照藥物采用Notch1特異性阻斷劑DAPT（5μM）。應(yīng)用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)分析COE對(duì)MHCC97-H細(xì)胞及TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的侵襲抑制;采用基質(zhì)膠小管形成實(shí)驗(yàn)觀

18、察COE對(duì)MHCC97-H細(xì)胞及TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞VM形成抑制。RT-PCR及Western Blot分析COE干預(yù)后兩種細(xì)胞Notch1、Hes1以及EMT標(biāo)記物vimentin、E-cadherin的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平;細(xì)胞骨架蛋白F-actin分布及表達(dá)采用熒光結(jié)合的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用GFP標(biāo)記的MHCC97-H細(xì)胞接種裸鼠皮下形成人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，造模成功后COE20、40、80mg/kg每天1次灌胃

19、給藥，DAPT20mg/kg每天1次腹腔注射作為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水為空白對(duì)照。每隔2d測(cè)量移植瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。第28d末次給藥后活體熒光觀察比較皮下移植瘤的熒光信號(hào)。剝?nèi)×鼋M織后稱重，切片病理觀察。PAS-CD34雙染色及TEM觀察各組血管擬態(tài)結(jié)構(gòu)。IHC檢測(cè)COE各濃度對(duì)移植瘤組織中Notch1、Hes1及EMT相關(guān)蛋白vimentin、E-cadherin表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　COE呈濃度及時(shí)間依賴性方

20、式抑制MHCC97-H細(xì)胞的增殖，作用MHCC97-H細(xì)胞24h的IC50為145.88μg/mL。COE各濃度(20、40、80μg/mL)及DAPT（5μM）處理細(xì)胞24h可有效抑制MHCC97-H及TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的侵襲及VM形成，COE80μg/mL濃度組作用接近DAPT效應(yīng)。Notch1及其下游靶基因Hes1在COE作用后轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平下降;細(xì)胞骨架重塑及vimentin表達(dá)在COE作用后受到抑制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果