格列本脲在腦出血后神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、腦水腫是腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后繼發(fā)腦損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的破壞是ICH后腦水腫重要的始動(dòng)因素。研究保護(hù)血腦屏障完整性的有效措施對(duì)減輕臨床腦出血后的繼發(fā)腦損傷具有重要意義。
　　格列本脲(Glibenclamide，GLC)為磺酰脲類(lèi)藥物，被臨床用于口服降糖已有數(shù)十年;磺酰脲類(lèi)藥物都是通過(guò)阻斷磺酰脲類(lèi)受體1(sulfonylurea

2、 receptor1，Sur1)發(fā)揮藥理作用?；酋ｋ孱?lèi)受體1參與構(gòu)成并調(diào)節(jié)Sur1-Kir6.2和Sur1-Trpm4兩種離子通道。Sur1-Kir6.2通道和Sur1-Trpm4通道有相反的生理學(xué)作用，Sur1-Kir6.2通道開(kāi)放細(xì)胞超激化，Sur1-Trpm4通道開(kāi)放時(shí)細(xì)胞去激化，細(xì)胞超激化和去激化參與不同的生理過(guò)程;Sur1-Trpm4通道去極化具有減少病理性鈣離子通過(guò)電壓門(mén)控通道內(nèi)流的作用，但如果失去正常調(diào)節(jié)，過(guò)度開(kāi)放陽(yáng)離子會(huì)

3、通過(guò)該通道內(nèi)流引起細(xì)胞毒性水腫和細(xì)胞壞死;Sur1-Kir6.2通道開(kāi)放細(xì)胞超激化具有減少鈣離子通過(guò)電壓門(mén)控通道內(nèi)流的重要作用，但如果過(guò)度開(kāi)放，ATP耗竭引起神經(jīng)元能量代謝紊亂并減慢小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)速度。最近格列本脲通過(guò)阻斷磺酰脲類(lèi)受體1在缺血性卒中、脊髓損傷、顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤、蛛網(wǎng)膜下腔出血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型研究中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)而被廣泛關(guān)注，糖尿病合并卒中患者回顧性研究分析發(fā)現(xiàn):卒中后磺酰脲類(lèi)藥物的使用可獲得更好的預(yù)后。課題

4、組前期研究成果及相關(guān)研究報(bào)道基質(zhì)金屬蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)在腦出血后血腦屏障完整性破壞中起重要作用，格列本脲能減少基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)或降低其活性。然而，格列本脲在腦出血中的作用目前仍不清楚。
　　本課題假設(shè)格列本脲能通過(guò)阻斷Sur1-Trpm4通道抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)、保護(hù)血腦屏障緊密連接蛋白從而發(fā)揮潛在的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng);課題選用大鼠自體血注射腦出血模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，觀察腦出后神經(jīng)功能缺損、血腦

5、屏障破壞、腦水腫的變化特征;并以血腫周?chē)X組織Sur1表達(dá)上調(diào)為前提，觀察探索格列苯脲對(duì)大鼠腦出血后腦水腫、血腦屏障、神經(jīng)功能的干預(yù)效應(yīng)和相關(guān)機(jī)制。為此，將課題分成了兩個(gè)研究部分來(lái)驗(yàn)證上述假設(shè):第一部分，建立成年SD大鼠腦出血模型，觀察出血損傷對(duì)大鼠腦組織磺酰脲類(lèi)受體1表達(dá)的影響;第二部分，建立大鼠腦出血模型后，給予格列本脲干預(yù)，觀察格列本脲對(duì)腦出血模型后腦水含量、神經(jīng)功能恢復(fù)、血腦屏障完整性、基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響。
　　一、

6、大鼠腦出血后血腫周?chē)鶶ur1表達(dá)
　　目的：
　　通過(guò)自體血注入方法建立大鼠ICH模型，動(dòng)態(tài)觀察出血后Sur1及相關(guān)離子通道表達(dá)變化，評(píng)估出血損傷對(duì)血腫周?chē)X組織Sur1表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成ICH組和Sham組;ICH組將自體血（取自實(shí)驗(yàn)大鼠股動(dòng)脈）100μL立即緩慢(約10μL/min)注入右側(cè)基底神經(jīng)節(jié);對(duì)照組與ICH組進(jìn)行同樣的手術(shù)過(guò)程，但不注入自體血液。于術(shù)后12h、24h、48

7、h收集腦標(biāo)本行PCR，術(shù)后24h收集腦標(biāo)本行Western blot檢測(cè)、免疫熒光染色。
　　結(jié)果：
　　大鼠實(shí)驗(yàn)性自體血腦出血模型血腫周?chē)X組織Sur1表達(dá)明顯上調(diào)，但Kir6.2通道蛋白未探及表達(dá)增加。因此推斷:出血性損傷后，血腫周?chē)X組織Sur1表達(dá)上調(diào)主要是伴隨Sur1-Trpm4通道的表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　出血性損傷后，血腫周?chē)X組織Sur1-Trpm4通道表達(dá)上調(diào)。
　　二、大鼠腦出血后格

8、列本脲的干預(yù)效應(yīng)
　　目的：
　　建立成年SD大鼠腦出血模型，給予格列本脲干預(yù);觀察大鼠ICH后的神經(jīng)功能缺損、腦水腫等情況以及運(yùn)用格列本脲干預(yù)的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，探討格列本脲神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的可能機(jī)制。
　　方法：
　　將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(Sham組)、ICH+Vehicle(Vehicle組)、ICH+GLC(GLC組);大鼠腦出血模型建立后CLC組立即給予格列本脲10μg/kg腹腔注射，并皮下植入微量泵以20

9、0ng/h的速度持續(xù)泵入（建模后15分鐘內(nèi)完成給藥）;Vehicle組用相同方式給予相同劑量的溶劑。在建模后24小時(shí)、72小時(shí)測(cè)定腦組織水含量;建模后每天行改良神經(jīng)功能評(píng)分(mNSS);建模后23天開(kāi)始行水迷宮測(cè)試訓(xùn)練;建模后24小時(shí)行Western blotting免疫印跡分析MMP9表達(dá)情況，72小時(shí)行Western blotting免疫印跡分析ZO-1、occludin表達(dá)情況;建模72小時(shí)切片行免疫熒光觀察血腦屏障完整性、MMP

10、9的表達(dá);建模后72小時(shí)切片觀察伊文思藍(lán)(Evans-blue)滲漏;建模后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)收集標(biāo)本行PCR檢測(cè)MMP2、MMP9、MMP12mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.格列本脲干預(yù)能減輕ICH后腦水含量，促進(jìn)ICH后神經(jīng)功能（改良的神經(jīng)功能評(píng)分）恢復(fù)。
　　2.格列本脲干預(yù)減少I(mǎi)CH后血腫周?chē)X組織伊文思藍(lán)滲漏。
　　3.格列本脲干預(yù)能改善ICH模型實(shí)驗(yàn)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力（通過(guò)水迷宮實(shí)