胃癌變相關分子事件研究SMC4在肺腺癌中的功能及相關分子機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 胃癌變相關分子事件研究
　　第一章 胃癌前病變及胃癌全基因組表達譜研究
　　背景:胃癌變是一個多階段、多因素、多基因參與的復雜過程。胃多階段癌變模型認為正常胃粘膜進展為胃癌需要以下幾個連續(xù)階段:正常胃粘膜→非萎縮性胃炎→多灶萎縮性胃炎→腸化生→低級別上皮內(nèi)瘤變→高級別上皮內(nèi)瘤變→癌。利用表達譜芯片技術全面系統(tǒng)的對胃癌前病變及胃癌序列進行分子生物學研究，具有重要的臨床和科研

2、價值。
　　目的:本課題旨在研究胃癌變各階段組織在分子表達譜水平上的相似性和差異性;篩選胃癌變過程中可能起關鍵作用的分子，挖掘胃癌早期診斷標志物。
　　方法:本部分研究收集了66對胃不同病變階段新鮮組織，包括20例低級別上皮內(nèi)瘤變、23例高級別上皮內(nèi)瘤變、19例早期胃癌、4例進展期胃癌和配對的鄰近染色正常組織，用于全基因組表達譜芯片的檢測;收集了50例胃癌患者的福爾馬林浸泡石蠟包埋組織樣本，一張切片上同時包括正常組織、癌前病

3、變組織和胃癌組織，利用免疫組織化學染色(immunochemistry，IHC)對表達譜芯片數(shù)據(jù)篩選出的分子進行驗證。
　　結(jié)果:胃癌前病變及胃癌樣本表達譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，在分子水平上胃癌前病變與胃癌具有相似性:很多腫瘤細胞的特征，例如DNA復制、細胞分裂、細胞周期等相關基因的上調(diào)以及生長負調(diào)控、支鏈氨基酸代謝等相關基因的下調(diào)，在癌前病變階段已經(jīng)顯現(xiàn);癌前病變組織和胃癌組織相對于鄰近組織有著相似的差異表達模式，在胃癌組織中差異表

4、達的基因絕大多在癌前病變階段已經(jīng)有了一致的差異表達。此外，胃癌前病變和胃癌在分子表達譜上存在差異性，主要涉及免疫反應和細胞粘附。一方面，我們發(fā)現(xiàn)562個基因可能參與了胃癌變過程，其中在蛋白互作網(wǎng)絡中最為核心且緊密聯(lián)系的8-基因模塊為CD40LG、CTLA4、GZMB、ICAM1、ITGAX、SELL、TGFB1、TNF，這些分子參與了淋巴細胞和單核細胞的遷移、免疫負調(diào)控、細胞外基質(zhì)組織等過程，與胃癌患者的總生存相關。另一方面，為了尋找胃

5、癌早期診斷標志物，我們挑選了4個在胃癌變過程中表達水平持續(xù)升高的基因進行后續(xù)免疫組化驗證，結(jié)果顯示，在胃癌變過程中，CCL3和CD300A的蛋白表達量和陽性率持續(xù)升高;與鄰近組織相比，OSM和CHI3L1在癌前病變組織和胃癌組織中的表達量和陽性率顯著升高，然而OSM和CHI3L1在癌前病變組織和胃癌組織中的表達量和陽性率沒有顯著差異。受試者工作特征曲線分析結(jié)果表明這四個分子對胃癌早期診斷可能具有一定的臨床價值。
　　結(jié)論:在分子水

6、平上胃癌前病變與胃癌具有相似性，胃癌前病變可能是胃癌發(fā)生的基礎。胃癌前病變和胃癌在分子表達譜上存在差異性，主要涉及免疫反應和細胞粘附，這些基因的變化可能與癌前病變向胃癌惡性轉(zhuǎn)化密切相關。8-基因模塊可能在胃癌變中發(fā)揮關鍵作用。CCL3，CD300A，CHI3L1和OSM是潛在的胃癌早期診斷標志物。以胃多階段癌變模型作為理論基礎，利用胃不同病變階段樣本對胃癌變過程進行研究，有助于闡明胃癌發(fā)生發(fā)展機制、尋找癌變關鍵分子和潛在的胃癌早期診斷標

7、志物。
　　第二章 胃癌前病變及胃癌TCR免疫組庫研究
　　背景:基于腫瘤浸潤淋巴細胞的免疫治療，主要依賴于抗原和T細胞受體(T-cellreceptor, TCR)的相互作用，已經(jīng)在實體瘤的治療中顯現(xiàn)出潛在的臨床應用價值。然而，TCR免疫組庫的很多基本特征仍然不清楚;癌變過程中TCR免疫組庫的變化，尤其是癌前病變階段，目前還沒有任何相關研究。
　　目的:本課題旨在探究胃癌變過程中組織浸潤TCR免疫組庫的特征以及病變組

8、織分子表型與病變微環(huán)境TCR免疫組庫的關系。
　　方法:研究納入了41例不同病變階段的胃組織樣本，包括低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、早期胃癌和配對的鄰近組織。我們通過多重PCR捕獲建庫和Ilumina Hiseq2000測序平臺對TCRβ互補決定區(qū)3進行了深度測序。此外，為了研究病變組織分子表型與病變微環(huán)境TCR免疫組庫的關系，我們對相應的胃癌前病變樣本和早期胃癌樣本進行了全基因組表達譜芯片檢測。
　　結(jié)果:分析結(jié)果顯

9、示，T細胞克隆多樣性和TCR免疫組庫的頻率分布在胃癌變過程中沒有顯著變化。然而，在胃癌變過程中，病變組織和配對鄰近組織TCR免疫組庫的相似性逐漸降低。病變組織和配對鄰近組織之間的TCR免疫組庫的重疊逐漸降低，為抗原驅(qū)動克隆擴增提供了直接的證據(jù);越來越多的病變抗原相關T細胞克隆變成了高頻克隆，而且它們占有的頻率在胃癌變過程中逐漸增加。此外，病變組織和配對鄰近組織之間的共有高頻T細胞克隆的頻率相似性在胃癌變不同階段迅速降低。最后，利用基于網(wǎng)

10、絡的派系過濾方法對表達譜芯片數(shù)據(jù)和TCR免疫組庫變異指數(shù)進行整合分析，我們找到了一個包含11個基因的模塊，這11個基因的表達量與胃癌病人的總生存顯著相關。
　　結(jié)論:我們的研究闡明了在胃癌變過程中組織浸潤TCR免疫組庫的多階段異質(zhì)性。突變細胞和免疫系統(tǒng)之間的相互作用可能在細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。本研究加深了我們對胃癌變過程中免疫反應的理解。
　　第二部分 SMC4在肺腺癌中的功能及相關分子機制研究
　　背景:越

11、來越多的證據(jù)顯示，胚胎發(fā)育和腫瘤形成在組織形態(tài)、細胞生物學學行為以及分子表達模式等方面具有極大的相似性。利用胚胎發(fā)育與腫瘤發(fā)生的相似性，重新審視正常發(fā)育的獨特過程，深入挖掘胚胎發(fā)育過程中分子譜的變化規(guī)律，可以在最大程度上規(guī)避腫瘤異質(zhì)性給研究帶來的種種困難。染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4(Structural maintenance of chromosome4，SMC4)是集縮素蛋白復合體(condensin)的核心蛋白，主要參與染色體的凝集和分

12、離。實驗室前期發(fā)表的人胚胎肺發(fā)育樣本和肺腺癌樣本mRNA表達譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，SMC4在胚胎肺發(fā)育過程中持續(xù)下調(diào)，在肺腺癌中卻呈現(xiàn)高表達。
　　目的:本課題旨在探索從肺發(fā)育數(shù)據(jù)中挖掘的蛋白SMC4在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的功能及相關分子機制。
　　方法:首先，利用實時定量PCR(Real-time PCR)對43對手術切除的肺腺癌組織及其癌旁組織的SMC4 mRNA表達水平進行驗證。接著，利用IHC對75例FFPE肺腺癌組

13、織及其癌旁組織的SMC4蛋白表達水平進行了驗證，并利用log-rank檢驗分析了SMC4表達量與肺腺癌病人生存的關系。利用CCK-8實驗和transwell實驗檢測SMC4對肺腺癌細胞增殖和侵襲的影響。為了進一步探索SMC4在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的機制，我們通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析找到了SMC4潛在的相互作用蛋白DDX46(DEAD-box helicase46)。最后，利用免疫共沉淀和免疫熒光共定位實驗驗證SMC4和DDX46的相互作用

14、。
　　結(jié)果:Real-time PCR和IHC分別從RNA和蛋白水平上證實了SMC4在肺腺癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織，而且SMC4蛋白高表達是肺腺癌獨立的預后不良因素（log-rank檢驗，p=0.036）。細胞實驗表明，SMC4敲降顯著抑制A549細胞的增殖和侵襲。此外，SMC4敲降后，與增殖相關的蛋白PLK1，Cyclin B1，CDK1表達量顯著下調(diào)。對人胚胎肺發(fā)育樣本和肺腺癌樣本mRNA表達譜數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，SM

15、C4和DDX46表達模式相似;Speraman相關性分析結(jié)果表明，SMC4和DDX46的mRNA表達水平顯著正相關(r=0.629，p＜0.0001)。正反向Co-IP證實SMC4和DDX46存在相互作用。免疫熒光共定位實驗發(fā)現(xiàn)，SMC4和DDX46在細胞周期的各個時相均存在共定位現(xiàn)象。
　　結(jié)論:SMC4在肺腺癌組織中的表達量顯著高于癌旁肺組織，而且SMC4蛋白高表達是肺腺癌獨立的預后不良因素。SMC4促進肺腺癌細胞的增殖和侵襲