旋覆花內(nèi)酯通過調(diào)制miR-155介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對缺血性腦組織發(fā)揮保護(hù)作用.pdf

1、ABL在腦缺血中的抗炎作用是否是通過調(diào)制miR-155表達(dá)而實現(xiàn)的，目前仍不清楚。本研究將分三部分對上述問題進(jìn)行探討，現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下:
　　第一部分 旋覆花內(nèi)酯對小鼠腦缺血誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的影響
　　目的:觀察ABL在缺血性腦損傷中的抗炎作用。
　　方法:選用成年雄性CD1小鼠，采用改良線栓法制備MCAO小鼠模型。將CD1小鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組（sham）、模型組(MCAO)、ABL小劑量組(ABL-L)、A

2、BL中劑量組(ABL-M)、ABL大劑量組(ABL-H)。
　　將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分為對照組(con)和氧糖剝奪處理組(OGD)，氧糖剝奪處理組再分為用ABL（100μmol/L）預(yù)處理24 h和不用ABL預(yù)處理組。ABL預(yù)處理組預(yù)先用100μmol/L的ABL預(yù)處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h。
　　腦缺血后24 h處死動物進(jìn)行觀察、檢測。
　　結(jié)果:
　　1.神經(jīng)功能評分:MCAO組明顯高于sham組(P＜0.0

3、5);ABL處理后，ABL-M組與ABL-H組神經(jīng)功能評分明顯低于MCAO組（P＜0.05）;但ABL-L組與MCAO組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2.腦組織水含量:MCAO組明顯高于sham組(P＜0.05);ABL處理后，ABL-H組和ABL-M組腦組織含水量明顯低于MCAO組（P＜0.05），ABL-L組腦組織含水量與MCAO組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.腦梗死體積:sham組表現(xiàn)為均勻一致

4、的紅色，MCAO組出現(xiàn)大范圍蒼白色梗死區(qū)域。ABL處理后，大、中、小三個劑量組蒼白色梗死區(qū)域體積均縮小。
　　4.ABL減輕了小鼠局灶性腦缺血損傷后的炎癥反應(yīng)。
　　5.ABL通過抑制TLR-4/NF-κB信號通路減輕炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)論:ABL可顯著改善局灶性腦缺血損傷后小鼠神經(jīng)功能缺損，減輕腦水腫，減小梗死體積，起到神經(jīng)保護(hù)作用;ABL通過抑制腦缺血引發(fā)的TLR4/NF-κB信號級聯(lián)減少TNF-α、IL-1β的表達(dá)

5、，同時通過上調(diào)TLR4/NF-κB途徑中的負(fù)調(diào)節(jié)因子MyD88和SOCS-1表達(dá)，發(fā)揮對腦缺血損傷的抗炎作用。
　　第二部分 miR-155在缺血性腦組織中的表達(dá)及旋覆花內(nèi)酯對miR-155表達(dá)的影響
　　目的:觀察miR-155是否參與缺血腦組織的炎癥反應(yīng)，以及ABL是否通過調(diào)節(jié)miR-155的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用。
　　方法:
　　實驗1:選用成年雄性CD1小鼠，采用改良線栓法制備MCAO小鼠模型。將CD1小鼠

6、隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(sham)、模型組(MCAO)、ABL小劑量組(ABL-L)、ABL中劑量組(ABL-M)、ABL大劑量組(ABL-H)。將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分為對照組(con)和氧糖剝奪處理組(OGD)，再分為用ABL（100μmol/L）預(yù)處理24 h和不用ABL預(yù)處理組。用qRT-PCR和報告基因方法檢測腦組織和BV2細(xì)胞中miR-155的表達(dá)。
　　實驗2:選用8周齡雄性miR-155基因敲除(miR-155 KO)

7、小鼠和野生型(wild-type，WT)小鼠，并向WT小鼠側(cè)腦室注射pAd-miR-155（pAd作為對照），以過表達(dá)miR-155。采用改良線栓法制備MCAO小鼠模型。ABL處理組MCAO術(shù)前30 min，腹腔注射ABL(20mg/kg)。在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)或敲低miR-155。腺病毒感染實驗用于在BV2中過表達(dá)miR-155; siRNA轉(zhuǎn)染用于在BV2中敲低miR-155。再分為ABL處理組（100μmol/L）和不用AB

8、L處理組，氧糖剝奪處理24 h。
　　腦缺血后24 h處死動物進(jìn)行觀察、檢測。各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評分、TTC染色評價梗死體積;應(yīng)用Western blotting和qRT-PCR方法檢測腦組織和細(xì)胞中TNF-α、IL-1β的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.缺血腦組織和OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中miR-155的表達(dá):qRT-PCR結(jié)果顯示，MCAO后24 h，與sham組相比，腦組織中miR-155的表達(dá)顯著升高（P＜0.

9、05），而ABL處理后，miR-155表達(dá)顯著減少，且呈劑量依賴性。BV2小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)OGD處理4h后miR-155的表達(dá)顯著升高(P＜0.05);用ABL預(yù)處理24 h，miR-155的表達(dá)則明顯下降(P＜0.05)。
　　2.神經(jīng)功能評分:MCAO24 h后，與WT組相比，miR-155KO組的神經(jīng)功能評分明顯降低(P＜0.05);而ABL處理不再繼續(xù)降低神經(jīng)功能評分(P＞0.05)。
　　3.腦梗死體積:MCAO24

10、h后，與WT組相比，miR-155KO組蒼白色梗死體積明顯縮小(P＜0.05);但ABL處理不再使梗死體積進(jìn)一步減少（P＞0.05）。
　　4.ABL抑制miR-155介導(dǎo)的炎癥反應(yīng):Western blotting結(jié)果顯示，梗死后，miR-155 KO小鼠缺血腦組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá)顯著減少(P＜0.05);ABL處理進(jìn)一步減少了miR-155 KO小鼠TNF-α和IL-1β的表達(dá)。在qRT-PCR結(jié)果中，我們觀察到

11、相似的變化。通過向WT小鼠側(cè)腦室注射pAd-miR-155使miR-155過表達(dá)后，則顯著增高缺血腦組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平，兩種炎癥因子的上調(diào)可被ABL輕微抑制。qRT-PCR的結(jié)果與蛋白表達(dá)變化相一致。細(xì)胞水平顯示，過表達(dá)miR-155顯著增加OGD誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的TNF-α和IL-1β表達(dá)(P＜0.05)。敲低miR-155則明顯減低了TNF-α和IL-1β的水平（P＜0.05），并且ABL處理能進(jìn)一步減少這

12、兩種炎性因子的表達(dá)。
　　結(jié)論:在缺血腦組織和OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中，miR-155表達(dá)顯著增加，ABL抑制miR-155的表達(dá);miR-155功能獲得和缺失實驗證實，miR-155介導(dǎo)TNF-α和IL-1β的表達(dá);ABL通過抑制miR-155表達(dá)來下調(diào)TNF-α和IL-1β的水平，從而起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。
　　第三部分 旋覆花內(nèi)酯通過抑制miR-155介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)而發(fā)揮腦保護(hù)作用
　　目的:揭示ABL調(diào)制mi

13、R-155表達(dá)及其抗炎作用的分子機(jī)制。
　　方法:選用8周齡雄性miR-155基因敲除（miR-155 KO）小鼠和野生型(wild-type，WT)小鼠，通過向WT小鼠側(cè)腦室注射pAd-miR-155使miR-155過表達(dá)。采用改良線栓法制備MCAO小鼠模型。MCAO前30min，ABL處理組向腹腔注射ABL(20 mg/kg)。在BV2細(xì)胞中過表達(dá)或敲低miR-155，腺病毒感染實驗用于在BV2細(xì)胞中過表達(dá)miR-155，si

14、RNA轉(zhuǎn)染實驗用于敲低miR-155。再分為ABL處理組（100μmol/L）和不用ABL處理組兩組。OGD處理24 h。
　　腦缺血后24 h處死動物進(jìn)行觀察、檢測。應(yīng)用Western blotting和qRT-PCR方法檢測腦組織和BV2細(xì)胞中TLR4、MyD88和SOCS1的表達(dá);用Western blotting檢測Akt、ERK、JNK和NF-κB等炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.ABL通

15、過調(diào)制TLR4/MyD88和SOCS1表達(dá)抑制miR-155介導(dǎo)的炎癥反應(yīng):Western blotting結(jié)果顯示，WT小鼠MCAO后24 h，TLR4條帶明顯可見，而TLR4表達(dá)在miR-155 KO小鼠中明顯降低（P＜0.05），同時，TLR4表達(dá)在miR-155 KO小鼠中不再因ABL處理而進(jìn)一步降低。miR-155 KO小鼠中MyD88和SOCS1的表達(dá)顯著高于WT小鼠(P＜0.05)，ABL處理與否對其表達(dá)無明顯影響。qRT

16、-PCR得到類似的結(jié)果。miR-155過表達(dá)小鼠的缺血腦組織中TLR4的表達(dá)顯著增高（P＜0.05）;ABL能顯著抑制TLR4的表達(dá)。相反，miR-155過表達(dá)降低MyD88和SOCS1的表達(dá)，ABL處理則上調(diào)其表達(dá)。我們進(jìn)一步用BV2細(xì)胞對整體水平的實驗結(jié)果進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)在OGD處理的BV2細(xì)胞中，miR-155過表達(dá)促進(jìn)TLR4，抑制MyD88和SOCS1的表達(dá)。敲除miR-155后，TLR4的表達(dá)下調(diào)，而MyD88和SOCS1的表

17、達(dá)增加。ABL孵育后，TLR4、MyD88和SOCS1的表達(dá)變化與整體實驗結(jié)果相一致。
　　2.ABL不直接作用于炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子:在過表達(dá)miR-155的小鼠，MCAO后缺血腦組織中p-Akt、p-ERK、p-JNK和p-NF-κB水平明顯升高。相反，miR-155敲除則使這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化水平降低。說明miR-155參與Akt、ERK、JNK和NF-κB的表達(dá)和/或激活。我們在BV2細(xì)胞水平上進(jìn)一步證實了整體水平上的實驗