旋覆花內(nèi)酯調(diào)制血管內(nèi)皮細胞黏附的作用機制.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種血管慢性炎癥反應疾病。當血管內(nèi)膜受損時，損傷部位的內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞等所釋放的各種炎癥因子，如tumornecrosis factor-α(TNF-α)，interleukin-1β(IL-1β)，interferon-γ(IFN-γ)等激活內(nèi)皮細胞，使其合成、分泌血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-

2、1)、細胞間黏附分子-1(intercellUar adhension molecule-1，ICAM-1)、osteopontin(OPN)和Tenascin-c等黏附相關蛋白。這些黏附分子促進血小板和單核細胞與內(nèi)皮細胞之間的黏附，并進一步促進炎性因子的釋放，使血管炎性反應加重。 NF-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)處于各種炎性因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡的中心環(huán)節(jié)，是炎癥反應的主要調(diào)控因子。NF-κB的活化可調(diào)節(jié)多種

3、基因的表達，包括炎性介質(zhì)、黏附分子、增殖與凋亡因子等，參與介導炎癥反應、免疫應答、細胞增殖與凋亡等病理生理過程。NF-κB的激活被認為是血管內(nèi)皮細胞受損的始動環(huán)節(jié)之一。因此，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞NF-κB的活性，阻斷炎性應答信號通路，減少血管損傷部位炎性介質(zhì)的釋放，對心血管疾病防治具有重要意義。 歐亞旋覆花(Inula Britannica-F)為菊科旋覆花屬植物，是具有降氣、消痰、止嘔和抗炎功效的常用中藥。旋覆花內(nèi)酯(1，6-O2

4、-acetylbritannilactone，ABLO2)是從歐亞旋覆花中分離得到的一種具有抗炎作用的單體，其是否對血管內(nèi)皮損傷誘發(fā)的炎性反應具有抑制作用尚不清楚。為了探討ABLO2對血管內(nèi)皮細胞炎性反應及黏附的影響及其作用機制，本文從以下幾方面進行了研究。 方法： 通過電泳遷移率改變分析(electrophoretic mobility shiftassay，EMSA)觀察ABLO2對核因子κB(NF-κB)p65與D

5、NA順式元件相互作用的影響：Western blot分析檢測NF-κB p65的表達及其核轉(zhuǎn)位以及IKK、p-IKK、IκBα、p-IκBα和黏附分子的表達變化；細胞黏附實驗、細胞跨膜遷移實驗檢測內(nèi)皮細胞黏附活性及單核細胞跨膜遷移能力的變化。 結果： 1.ABLO2抑制NF-κB活化及核轉(zhuǎn)位Western blot結果顯示：LPS/IFN-γ刺激ECV304細胞30min后，核內(nèi)NF-κB p65的水平明顯升高，1 h后

6、達高峰。用20 μmol/LABLO2預處理ECV304細胞2 h后，再用LPS/IFN-γ處理細胞，p65核轉(zhuǎn)位受到明顯抑制，表明ABLO2可抑制LPS/IFN-γ誘導的p65活化與核轉(zhuǎn)位。 2.ABLO2抑制p65與DNA順式元件的相互作用以5’末端標記的含有NF-κB結合基序的雙股寡核苷酸為探針，分別與不同條件處理的ECV304細胞核蛋白進行結合反應。經(jīng)電泳分離后，放射自顯影可見，從LPS/IFN-γ處理的ECV304細胞

7、中提取的核蛋白與探針的結合活性顯著增加，在5％PAGE上出現(xiàn)滯后的DNA-蛋白質(zhì)復合物區(qū)帶，經(jīng)20μmol/L ABLO2預孵育2 h后，LPS誘導的核蛋白與探針的結合活性受到明顯抑制。 3.ABLO2抑制IκBα磷酸化與降解Western blot分析結果顯示，對照細胞的胞漿中含有較高水平的IκBα，其磷酸化水平相對較低，用LPS/IFN-γ刺激ECV304細胞10 min、30 min、1 h后，IκBα磷酸化水平快速、短暫

8、升高，于刺激10 min時達高峰，而IκBα水平變化與其磷酸化水平呈相反趨勢。用20μmol/L ABLO2預處理ECV304細胞2 h后，LPS/IFN-γ誘導的IκBα磷酸化及IκBα降解受到明顯抑制，以誘導10 min時作用最明顯。提示ABLO2能抑制IκBα磷酸化與降解。 4.ABLO2抑制IKK的活化Western blot結果顯示，用LPS/IFN-γ刺激ECV304細胞10 min后，IKK磷酸化水平明顯升高，以刺

9、激30 min時最為明顯，達對照組的13.12倍;用ABLO2預處理細胞2 h后，LPS/IFN-γ誘導的IKK磷酸化水平比未預孵育組降低73％。 5.ABLO2抑制NF-κB依賴的黏附分子表達Western blot分析結果表明，在常規(guī)培養(yǎng)的ECV304細胞中，黏附分子VCAM-1、OPN、MMP-9、Tenascin-c的表達水平均較低，給予10 μg/ml LPS/IFN-γ刺激ECV304細胞6 h、12 h、24 h時

10、，這些基因的表達水平明顯升高，其中MMP-9、OPN、VCAM-1在刺激12 h后，分別較對照組升高3.14、5.2、2.3倍，Tenascin-c在刺激6 h后明顯升高，比對照組增加4.5倍，并維持該水平至24 h。用20 μmol/L ABLO2預處理細胞能明顯抑制LPS/IFN-γ誘導的VCAM-1、OPN、MMP-9、Tenascin-c的表達，與LPS/IFN-γ刺激12 h組比較，這些基因的表達水平分別降低61.3％、77.

11、5％、62.6％、78.4％。說明ABLO2可明顯抑制上述基因表達。 6.ABLO2抑制單核-內(nèi)皮細胞黏附作用單核-內(nèi)皮細胞黏附實驗結果顯示，LPS/IFN-γ刺激ECV304細胞30 min，可顯著增加單核細胞.內(nèi)皮細胞的黏附，其黏附率較對照組增加4.7倍，與ABLO2預孵育2 h后，黏附于內(nèi)皮細胞的單核細胞明顯減少，下降至LPS/IFN-γ組的52％。 7.ABLO2抑制RAW264.7細胞的跨膜遷移細胞跨膜遷移分析

12、顯示，LPS/IFN-γ刺激6 h，RAW264.7細胞穿越PVPF膜的細胞數(shù)較未刺激組明顯增加，ABLO2預處理2 h后，再用LPS/IFN-γ刺激6 h，跨膜遷移的RAW264.7細胞數(shù)較刺激組降低15.4％(p<0.05)。說明ABLO2能夠抑制LPS/IFN-γ誘導的RAW264.7細胞的跨膜遷移活性。 結論： 1.ABLO2通過抑制NF-κB經(jīng)典激活途徑中的IKK磷酸化而抑制LPS/IFN-γ誘導的IκBα磷酸