原花青素通過(guò)激活STAT3通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:盡早實(shí)行再灌注治療是缺血性心臟病治療的關(guān)鍵，然而，再灌注后可以引起缺血/再灌注損傷(IRI)。近年來(lái)研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)在IRI的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。藥物預(yù)適應(yīng)是緩解心肌IRI的有效措施，原花青素(PC)是一種強(qiáng)效的天然抗氧化劑，具有眾多生物活性，如抗凋亡、抗腫瘤、保護(hù)心血管等作用。考慮到ERS在心肌IRI中扮演的重要角色，以及PC對(duì)心肌IRI的保護(hù)作用，我們?cè)O(shè)想內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能為PC減輕心肌IRI損傷的作用靶點(diǎn)。本研究

2、以大鼠H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)模型為研究對(duì)象，第一部分研究觀察PC對(duì)H/R損傷后心肌細(xì)胞存活率、乳酸脫氫酶(LDH)活性、細(xì)胞凋亡程度以及ERS標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）表達(dá)的影響，并探討PC劑量效應(yīng)關(guān)系;第二部分研究觀察PC對(duì)H/R后細(xì)胞凋亡程度、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活子3(STAT3)通路、ERS及其相關(guān)凋亡通路蛋白和基因表達(dá)的影響，并觀察應(yīng)用STAT3特異性抑制劑Stattic處理后以上各參數(shù)的變化，探討STA

3、T3通路在PC保護(hù)H/R后心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮的作用，以及STAT3通路與ERS的關(guān)系及調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:1.建立缺氧/復(fù)氧模型，探索最佳復(fù)氧時(shí)間:H9C2心肌細(xì)胞（購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)）分為6組，分別為空白對(duì)照組、缺氧3h復(fù)氧1h組、缺氧3h復(fù)氧3h組、缺氧3h復(fù)氧6h組、缺氧3h復(fù)氧12h組、缺氧3h復(fù)氧24h組。缺氧培養(yǎng)時(shí)將培養(yǎng)基更換為無(wú)糖無(wú)血清、缺氧的DMEM培養(yǎng)基置于37℃充滿95％N2和5％ C

4、O2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h，然后更換為正常培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱分別行不同時(shí)間復(fù)氧，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，檢測(cè)細(xì)胞LDH活性，確定最佳復(fù)氧時(shí)間nh。
　　2.觀察PC對(duì)H/R后心肌細(xì)胞保護(hù)作用:H9C2心肌細(xì)胞分為6組:1）空白對(duì)照組;2）缺氧/復(fù)氧組（H/R組）:將細(xì)胞置于37℃、充滿95％N2、5％CO2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧3h，然后更換DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、充滿95％空氣、5％CO2的培

5、養(yǎng)箱內(nèi)按探索的最佳復(fù)氧時(shí)間復(fù)氧nh;3）缺氧/復(fù)氧+低劑量原花青素組（H/R+LPC組）:50μg/ml PC孵育細(xì)胞30min后行缺氧/復(fù)氧過(guò)程;4）缺氧/復(fù)氧+中劑量原花青素組（H/R+MPC組）:100μg/ml PC孵育細(xì)胞30min后行缺氧/復(fù)氧過(guò)程;5）缺氧/復(fù)氧+高劑量原花青素組（H/R+HPC組）:200μg/ml PC孵育細(xì)胞30min后行缺氧/復(fù)氧過(guò)程;6）缺氧/復(fù)氧+4-苯基丁酸鈉組（H/R+4-PBA組）:1mM

6、4-PBA孵育細(xì)胞30min后行缺氧/復(fù)氧過(guò)程。各組細(xì)胞處理后光鏡下、透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，檢測(cè)細(xì)胞LDH活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Westem blotting檢測(cè)細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)水平。
　　第二部分:H9C2心肌細(xì)胞分為7組:1）空白對(duì)照組;2）原花青素組(PC組):H9C2心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)，采用100μg/ml PC處理細(xì)胞30min;3）Stattic組（S組）:采用1μM Statti

7、c處理細(xì)胞1h;4）缺氧/復(fù)氧組（H/R組）:將細(xì)胞置于37℃、充滿95％N2、5％CO2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧3h，然后更換DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、充滿95％空氣、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧nh;5）缺氧/復(fù)氧+原花青素組（H/R+PC組）:先給予細(xì)胞100μg/ml PC預(yù)處理30 min，再按H/R組過(guò)程行缺氧/復(fù)氧過(guò)程;6）缺氧/復(fù)氧+Stattic組（H/R+S組）:細(xì)胞缺氧/復(fù)氧前加入1μM Stattic預(yù)處理1h，再按H/

8、R組過(guò)程行缺氧/復(fù)氧過(guò)程;7）缺氧/復(fù)氧+原花青素+Stattic組（H/R+PC+S組）:細(xì)胞經(jīng)1μM Stattic預(yù)處理1h后，加入100μg/ml PC孵育30 min，再按H/R組過(guò)程行缺氧/復(fù)氧過(guò)程。各組細(xì)胞處理后MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blotting檢測(cè)細(xì)胞STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、GRP78、PERK、磷酸化PERK(p-PERK)、CHOP、IRE1、磷酸

9、化IRE1(p-IRE1)、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)、ATF6、Caspase-12蛋白的表達(dá)，Real-Time PCR檢測(cè)細(xì)胞GRP78、PERK、CHOP、JNK、ATF6、Caspase-12 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　第一部分:1、1）光鏡下顯示，對(duì)照組心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞呈梭形或多角形，簇狀生長(zhǎng)，細(xì)胞折光性強(qiáng)。隨著復(fù)氧的開始，細(xì)胞變圓、拉長(zhǎng)，細(xì)胞折光性下降，存活細(xì)胞數(shù)目減少，圓形漂浮細(xì)胞增

10、多，其中復(fù)氧3h、6h比復(fù)氧1h存活細(xì)胞明顯減少，復(fù)氧3h、6h比較細(xì)胞形態(tài)差別不大，復(fù)氧12h、24h較3h、6h圓形漂浮細(xì)胞更多。2）與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞存活率下降，復(fù)氧后3h、6h、12h、24h細(xì)胞存活率與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.01);復(fù)氧后3h、6h、12h、24h各組之間細(xì)胞存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。3)與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞LDH活性均明顯上升(P＜0.01);復(fù)氧后3h、6h、12h各組細(xì)胞之間的

11、LDH活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);故選擇復(fù)氧3h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)H/R模型復(fù)氧時(shí)間。
　　2、1)光鏡下顯示，與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯損傷變化，不同濃度PC預(yù)處理和4-PBA預(yù)處理可改善細(xì)胞形態(tài)的變化。2）透射電鏡下顯示，與對(duì)照組相比，H/R組心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷，表現(xiàn)為核膜缺損，線粒體腫脹、空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，并出現(xiàn)大量凋亡小體;不同濃度PC預(yù)處理和4-PBA預(yù)處理可改善細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化。3）與對(duì)照組相比，H

12、/R組細(xì)胞存活率顯著降低(P＜0.01);與H/R組相比，H/R+M/HPC組心肌細(xì)胞存活率顯著提高（P＜0.01），H/R+LPC組細(xì)胞存活率升高不明顯(P＞0.05)，其中H/R+MPC組細(xì)胞存活率提高最多;中、高劑量PC預(yù)處理組與4-PBA預(yù)處理組心肌細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異(P＞0.05)。4）與對(duì)照組相比，H/R組心肌細(xì)胞LDH活性明顯升高(P＜0.01);與H/R組相比，不同濃度PC預(yù)處理組的LDH活性均明顯降低(P＜0.05)

13、;不同濃度PC預(yù)處理組和4-PBA預(yù)處理組間LDH活性無(wú)明顯差異（P＞0.05）。5）與對(duì)照組相比，H/R組心肌細(xì)胞凋亡和壞死數(shù)量顯著上升（P＜0.01）;與H/R組相比，不同濃度PC預(yù)處理組心肌細(xì)胞凋亡及壞死出現(xiàn)不同程度的明顯減少(P＜0.05)，中劑量PC組細(xì)胞凋亡減少最明顯;中劑量PC預(yù)處理組心肌細(xì)胞凋亡率與4-PBA預(yù)處理組未見明顯差異，而低、高劑量PC預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率高于4-PBA預(yù)處理組(P＜0.05)。6)H/R組蛋白G

14、RP78表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(P＜0.01)，不同濃度PC預(yù)處理組GRP78蛋白表達(dá)皆下降(P＜0.05);GRP78蛋白表達(dá)在H/R+MPC組與H/R+4-PBA組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)，而H/R+LPC、H/R+HPC組GRP78蛋白表達(dá)量稍高于H/R+4-PBA組（P＜0.05）。
　　第二部分:1、與對(duì)照組相比，PC組和S組細(xì)胞存活率、凋亡率、蛋白和mRNA表達(dá)皆無(wú)明顯變化(P＞0.05，除外S組p-STAT3/ST

15、AT3表達(dá)低于對(duì)照組和PC組)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中PC和Stattic藥物濃度對(duì)心肌細(xì)胞無(wú)損傷。
　　2、與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞存活率顯著下降，凋亡率顯著升高(P＜0.01)。與H/R組相比，PC預(yù)處理可顯著提高細(xì)胞存活率、減少細(xì)胞凋亡(P＜0.01);應(yīng)用了STAT3通路阻斷劑后，PC的改善作用明顯減弱（P＜0.01）。
　　3、與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞p-STAT3/STAT3比值顯著上升(P＜0.01)。與H/R組相比

16、，PC預(yù)處理使STAT3磷酸化進(jìn)一步增加(P＜0.01);給予STAT3特異性抑制劑Stattic后，PC激活STAT3磷酸化的作用被抑制(P＜0.01)。
　　4、與對(duì)照組相比，H/R組ERS及其凋亡通路相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)皆顯著上升(P＜0.01)。與H/R組相比，PC預(yù)處理抑制了ERS及其凋亡通路相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)（P＜0.01）;給予STAT3特異性抑制劑Stattic后，PC對(duì)H/R誘導(dǎo)的蛋白和mRNA高表達(dá)的保

17、護(hù)作用被抑制(P＜0.01)。PERK、JNK的mRNA表達(dá)各組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、缺氧3h復(fù)氧3h為本實(shí)驗(yàn)中H9C2心肌細(xì)胞最佳H/R模型制備時(shí)間。
　　2、PC預(yù)處理可通過(guò)抑制ERS減少H/R引起的細(xì)胞損傷和凋亡，PC作用效果不隨濃度增加而增大，本研究100μg/ml PC對(duì)H3h/R3h心肌細(xì)胞提供最佳保護(hù)作用。
　　3、心肌細(xì)胞H/R過(guò)程中，PC可激活STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路