中國(guó)多中心連續(xù)五年侵襲性感染熱帶念珠菌流行病學(xué)及唑類耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的：熱帶念珠菌是臨床侵襲性真菌感染的重要病原菌，病死率高。在中國(guó)，其對(duì)唑類藥物的耐藥性已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。本研究對(duì)中國(guó)侵襲性感染熱帶念珠菌的體外藥物敏感性變遷、分子流行病學(xué)特征及對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究。
　　方法：本研究選取了2009年8月至2014年7月連續(xù)五年參加CHIF-NET的十家監(jiān)測(cè)中心收集的所有非重復(fù)侵襲性感染熱帶念珠菌進(jìn)行研究，總納入菌株數(shù)507株。在菌株準(zhǔn)確鑒定的基礎(chǔ)上，測(cè)定菌株9種抗真菌藥物的最

2、小抑菌濃度。同時(shí)計(jì)算監(jiān)測(cè)期內(nèi)氟康唑、伏立康唑抗菌藥物使用強(qiáng)度。利用本研究新建立的針對(duì)熱帶念珠菌的微衛(wèi)星分型體系，對(duì)全部507株菌進(jìn)行分子分型，進(jìn)而進(jìn)行聚類及同源性分析。耐藥機(jī)制研究方面，對(duì)氟康唑耐藥組與敏感組菌株的靶位點(diǎn)基因ERG11及泵蛋白基因MDR1、CDR1以及線粒體細(xì)胞色素b基因CYTb進(jìn)行熒光定量PCR分析，以分析不同表型組別之間基因表達(dá)量的差異。此外，對(duì)所有507菌株ERG11基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，篩查堿基突變位點(diǎn)。利用pYES

3、2/CT質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，對(duì)潛在的唑類耐藥錯(cuò)義突變進(jìn)行功能驗(yàn)證。另外，使用三種唑類對(duì)1株臨床分離株進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥，觀察不同藥物誘導(dǎo)菌株對(duì)唑類藥物的MIC值變化，并檢測(cè)其耐藥機(jī)制。
　　結(jié)果：侵襲性熱帶念珠菌感染中，最常見的血流感染，占到53.4％(220/507)。體外抗菌藥物敏感性結(jié)果顯示，23.1％和20.7％的菌株對(duì)氟康唑及伏立康唑不敏感。同時(shí)，有11.4％的菌株呈現(xiàn)氟康唑、伏立康唑交叉耐藥的現(xiàn)象。對(duì)于棘白菌素類藥物，99

4、％以上的菌株敏感。唑類藥物非敏感率在監(jiān)測(cè)五年期間有顯著增長(zhǎng)的趨勢(shì)，對(duì)氟康唑的非敏感率由11.2％增長(zhǎng)至42.7％;對(duì)伏立康唑的非敏感率由10.4％增長(zhǎng)至39.1％。氟康唑-伏立康唑交叉耐藥的耐藥率也由6.6％上升至21.7％。但是，唑類非敏感率的上升與臨床唑類藥物使用強(qiáng)度沒(méi)有相關(guān)性。
　　對(duì)比分子分型“金標(biāo)準(zhǔn)”脈沖場(chǎng)凝膠電泳，本研究新建的ctm1-ctm3-ctm24三位點(diǎn)微衛(wèi)星分型體系的分辨力能夠達(dá)到0.99。507株熱帶念珠菌

5、中，共檢出296個(gè)微衛(wèi)星型，其中最常見的基因型為MT178型，占比4.1％?？傮w來(lái)講，菌株分子型別散在，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)地域聚集現(xiàn)象。但是，結(jié)合體外抗真菌藥物敏感性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟康唑非敏感菌株相對(duì)集中在四個(gè)微衛(wèi)星群中，尤其是Ⅳ群，24株菌全部為氟康唑-伏立康唑交叉耐藥株。
　　綜合分析本研究收集菌株的唑類耐藥機(jī)制，ERG11基因的錯(cuò)義突變是導(dǎo)致唑類耐藥的最主要原因，65株氟康唑耐藥株中，僅有3株未發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)突變。ERG11基因A395T

6、/W&C461T/Y雙突變?cè)诜颠蚰退幘袡z出頻率最高，能夠占到耐藥菌總數(shù)的76.9％(50/65)。載體構(gòu)建功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，A395T單突變即可導(dǎo)致菌株唑類MIC值急劇升高，但相反C461T突變對(duì)菌株的唑類藥物敏感性并無(wú)影響。同時(shí)，ERG11基因T374C、T769C、G1390A均會(huì)導(dǎo)致菌株唑類MIC值的大幅升高，但A983G突變與耐藥無(wú)關(guān)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，氟康唑耐藥組ERG11基因的平均表達(dá)水平高于敏感組;耐藥組CYTb基因

7、的表達(dá)量低于敏感組。相比，CDR1、MDR1基因平均表達(dá)水平不同組間并無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：中國(guó)侵襲性感染相關(guān)熱帶念珠菌對(duì)氟康唑和伏立康唑呈現(xiàn)高度唑類耐藥性，并且近年來(lái)呈現(xiàn)明顯的持續(xù)升高的趨勢(shì)，尤其是監(jiān)測(cè)后兩年耐藥率急劇升高。臨床分離熱帶念珠菌基因背景整體呈現(xiàn)多態(tài)性，但發(fā)現(xiàn)了與氟康唑非敏感表型相關(guān)的克隆群。ERG11基因的錯(cuò)義突變是引起中國(guó)熱帶念珠菌唑類耐藥的最主要原因，絕大多數(shù)的氟康唑耐藥菌是由A395T錯(cuò)義突變導(dǎo)致。同時(shí)，E